Москалев А.А. Старение и гены

Подождите немного. Документ загружается.

же аберрантные белки, часто формирующие агрегаты (агресомы).

Накопление липофусцина препятствует автофагическому мито-

хондриальному обмену, стимулируя накопление постаревших ми-

тохондрий, которые плохо вырабатывают АТФ, но образуют все

большее количество активных форм кислорода. Оксидативный

стресс далее стимулирует повреждение митохондрий и лизосом,

снижая способность к адаптации, запуская митохондриальные и

лизосомальные проапоптозные пути, последнее приводит к ги-

бели клетки (Terman et al., 2007).

Подводя итоги следует сказать, что возрастзависимое сниже-

ние эффективности систем детоксификации, протеолиза и авто-

фагии приводит к накоплению вредных молекул, отработанных

белковых и липидных агрегатов и нефункциональных органелл.

Подобный «мусор» в свою очередь нарушает нормальные клеточ-

ные процессы и еще больше ингибирует детоксификацию и авто-

фагию. Возникает порочный круг. Сверхактивация компонентов

этих защитных систем методами молекулярной генетики вызы-

вает увеличение продолжительности жизни.

Глава 4

СТАРЕНИЕ И СТРЕСС

Стресс — это внезапное изменение, индуцирующее по-

вреждения на молекулярном, клеточном и организменном уровнях.

Однако стресс также вызывает адаптивный ответ, который обычно

компенсирует его. Такая способность носит название «стрессо-

устойчивость». Полезный эффект умеренного стресса заключает-

ся в том, что он позволяет организму справиться с последующим

более жестким стрессом. В случае умеренного стресса с отсутст-

вием явных повреждений такой феномен называется «гормезис».

Если же повреждение перевешивает адаптацию, то это приводит

к функциональному спаду и так называемому «дистрессу» (Soti,

Csermely, 2007).

Положительная корреляция продолжительности жизни и

стрессоустойчивости, впервые выявленная у долгоживущих мутан-

тов нематод, предполагает, что способность распознавать и отве-

чать на внешнесредовые вызовы важна для регулирования продол-

жительности жизни (Morley, Morimoto, 2004). Активация стресс-

ответа на любой стимул индуцирует перекрестную толерантность

к множеству стресс-факторов. В то же время устойчивость к любо-

му физическому стрессу коррелирует с продолжительностью жиз-

ни у многих, если не у всех, видов живых существ (Soti, Csermely,

2007). Например, оксидативное повреждение ускоряет старение,

тогда как устойчивость к данному виду повреждения удлиняет

жизнь. Поэтому все долгоживущие мутанты Caenorhabditis ele-

gans устойчивы к оксидативному повреждению (Guarente, Kenyon,

2000).

212

4.1. Окислительный стресс

4.1.1. Теория интенсивности жизнедеятельности

В начале XX века (в 1908 г.) немецкий физиолог Макс

Рубнер провел серию исследований филогенетических аспектов

старения. Он показал, что у некоторых видов существует обрат-

ная корреляция между продолжительностью жизни и темпом ме-

таболизма, а также прямая зависимость долгожительства от раз-

меров тела (цит. по: Sapolsky, 2004). Так, живущая 2 года крыса

имеет в покое частоту сердечных сокращений 400 ударов в ми-

нуту, а слон, доживающий до 60 лет, — 35 ударов (Speakman,

2005).

В 20-х годах XX века Раймонд Пирл использовал дрозофилу,

чтобы показать, что продолжительность жизни является наследуе-

мым признаком (Pearl et al., 1923). Эксперименты Пирла приве-

ли к возникновению теории «интенсивности жизнедеятельнос-

ти» (rate-of-living), ставшей впоследствии теорией оксидативного

стресса. В 1928 г. Пирл распространил свою теорию на теплокров-

ных, у которых он наблюдал прямую корреляцию между разме-

ром тела и продолжительностью жизни, и обратную — между

продолжительностью жизни и темпом метаболизма (Pearl, 1928).

Для Пирла был неясен точный механизм, связывающий метабо-

лизм и старение. Он предполагал, что некие клеточные элементы

расходуются пропорционально общему темпу метаболизма. Ког-

да эти неизвестные жизненные элементы истощаются, наступает

гибель (Balaban et al., 2005).

Основываясь на взглядах предшественников, Денхам Хар-

ман предложил «свободнорадикальную теорию» старения (Har-

man, 1956). Эта теория в целом соответствовала ранее высказы-

вавшимся представлениям, предполагавшим корреляцию между

темпом метаболизма и продолжительностью жизни. Кроме того,

теория Хармана постулировала, что старение и ассоциированные

с ним дегенеративные заболевания возникают благодаря повреж-

дающему действию свободных радикалов на различные компо-

ненты клетки. Его концепция вызывала ожесточенное проти-

водействие до тех пор, пока Маккорд и Фридович не открыли

фермент супероксиддисмутазу (McCord, Fridovich, 1969). Сущест-

вование внутриклеточного фермента, очищающего от суперок-

сида, стало важным свидетельством в пользу того, что клетка

постоянно вырабатывает свободные радикалы. Харман предполо-

жил, что причиной возникновения старение-индуцирующих сво-

бодных радикалов, вероятно, служит «взаимодействие дыхатель-

213

ных ферментов, вовлеченных в прямую утилизацию молекуляр-

ного кислорода» (цит. по: Balaban et al., 2005).

Позднее внимание сместилось от межвидовых различий к изу-

чению взаимосвязи сбоев метаболического гомеостаза и ускорен-

ного старения. Гипотеза «износа» привела к появлению парадиг-

мы, согласно которой дистресс может ускорять старение. Напри-

мер, многократные перегрузки системы гомеостаза глюкозы могут

приводить к диабету II типа, а также к старению через нефермен-

тативное образование гликозилированных белков. Пролонгиро-

ванная глубокая эмоциональная депрессия увеличивает риск сер-

дечных заболеваний. Поиск механизмов таких феноменов привел

к обоснованию связей между гормонами стресса и выработкой

свободных радикалов (Sapolsky, 2004).

Большой вклад в исследование проблем свободнорадикаль-

ного старения и в разработку методов его замедления (геропротек-

торов и антиоксидантов) внесли отечественные ученые — акад.

Н. М. Эммануэль (см.: Эммануэль, 1981), Л. К. Обухова (1975),

Е. Б. Бурлакова (Бурлакова, Молочкина, 1973), В. Х. Хавинсон

(Хавинсон и др., 2003) и В. Н. Анисимов (2003).

4.1.2. Свободные радикалы и старение

Теперь мы знаем, что клетки постоянно вырабатывают

свободные радикалы. При физиологических условиях около 0.2 %

общего потребляемого кислорода уходит на их генерирование,

которое осуществляется во многих компартментах клетки и при

участии многих ферментов. Важный вклад в этот процесс вносят

белки плазматической мембраны (принадлежащие к семейству

NADPH-оксидаз), липидный метаболизм в пероксисомах, актив-

ность различных цитозольных ферментов (таких как циклоокси-

геназы). Однако наиболее значителен вклад митохондрий — око-

ло 90 %. Образование активных форм кислорода в митохонд-

риях является следствием окислительного фосфорилирования —

процесса, использующего контролируемое окисление NADH или

FADH для запасания потенциальной энергии протонов (ΔΨ) во

внутренней мембране митохондрий. Эта потенциальная энергия

в свою очередь используется для фосфорилирования АДФ через

F1-F0-АТФазу. В нескольких местах цепи цитохромов электроны,

получаемые от NADH или FADH, могут напрямую реагировать

с кислородом или другими акцепторами электрона и генерировать

свободные радикалы. Ранее эти события рассматривали как по-

бочную реакцию, однако теперь убеждены, что митохондриаль-

ные активные формы кислорода играют большую роль в раз-

214

личных redox-зависимых сигнальных процессах. Вполне вероятно

также, что они служит механизмом «часов старения» (Turrens,

2003; Balaban et al., 2005).

Два главных участка генерации активных форм кислорода —

комплексы I и III электронотранспортной цепи, где происходят

большие изменения потенциальной энергии электронов, связан-

ные с восстановлением кислорода. Экспериментальные манипу-

ляции, увеличивающие окислительно-восстановительный потен-

циал в комплексах I или III, повышают темп выработки активных

форм кислорода. Участок I является мультисубъединичным комп-

лексом, состоящим из 46 белков с общей молекулярной массой 1

МДа и по крайней мере из одного связанного флавинмонону-

клеотида и 8 железосерных групп. Как железосерные, так и фла-

винмононуклеотидные группы участвуют в выработке активных

форм кислорода (Balaban et al., 2005). Здесь возникает одна треть

общего количества митохондриальных свободных радикалов. Кро-

ме того, они образуются глицерол-3-фосфатдегидрогеназой, про-

дуцирующей активные формы кислорода на цитозольную сторону

митохондриальной мембраны (Miwa et al., 2004). В комплексе III

–

образуется посредством восстановленного убисемихинона либо

на внутренней, либо на внешней поверхности мембраны. Этап тер-

минального окисления на цитохром c оксидазе в интактной систе-

ме не вносит существенного вклада в образование активных форм

кислорода (Turrens, 2003; Balaban et al., 2005).

Как известно, увеличение темпов образования активных форм

кислорода или снижение каталитической детоксификации их в

результате снижения антиоксидантной защиты вызывает струк-

турные модификации в ДНК, белках и липидах (Bayne et al., 2005;

Ferguson et al., 2005). Накопление оксидативных повреждений с

возрастом может происходить через увеличение образования сво-

бодных радикалов, а также через снижение антиоксидантной спо-

собности и репарации оксидативных повреждений, деградации

окисленных макромолекул, либо через комбинацию этих меха-

низмов (Martin, Grotewiel, 2006).

Супероксиддисмутаза, локализованная в митохондриях, пре-

вращает O

–

в перекись водорода, которая в свою очередь распа-

дается под действием митохондриальных пероксидаз или диффун-

дирует в цитозоль. Перекись водорода может быстро диффундиро-

вать через клеточные мембраны и подвергаться расщеплению до

высокоактивного гидроксил-радикала, способного вызывать окси-

дативные повреждения разнообразных макромолекул (Bayne et al.,

2005; Ferguson et al., 2005). Открытие супероксиддисмутазы было

важным шагом в обосновании роли митохондрий в выработке сво-

бодных радикалов и H

(McCord, Fridovich, 1969). Существует

215

два внутриклеточных фермента с активностью супероксиддис-

мутазы: SOD2 (Mn-зависимый фермент в матриксе митохондрий)

и SOD1 (Cu,Zn-содержащий фермент цитозоля). Оба фермента

превращают O

–

в перекись водорода, которая затем деактиви-

руется или каталазой до воды и кислорода, или различными глу-

татион-пероксидазами до восстановленного глутатиона и воды.

Пероксиредоксины представляют собой еще одно семейство важ-

ных перехватчиков свободных радикалов в митохондриях. Су-

пероксид, который не был немедленно деактивирован, напрямую

взаимодействует с окисленным цитохромом c или цитохром-ок-

сидазой. Эта эффективная система утилизации приводит к тому,

что количество свободных радикалов, выходящих из митохонд-

рий, гораздо меньше генерируемого (Хавинсон и др., 2003; Bala-

ban et al., 2005).

Трипептид γ-глутамил-цистеинил-глицин, известный также как

глутатион (GSH), — многосторонний биологический восстано-

витель. GSH синтезируется в результате последовательного дей-

ствия двух ферментов: глутамат-цистеинлигазы, катализирующей

первый шаг синтеза de novo, и глутаматсинтазы, связывающей

глицин с γ-глутамил-цистеином для формирования глутатиона.

Последний осуществляет множество физиологических функций,

исполняя роль субстрата ферментативного восстановления пер-

оксидов и коньюгата ксенобиотиков для облегчения их экспорта

из клетки, а также участвуя в транспорте аминокислот, тиолиро-

вании/детиолировании белков и поддержании клеточного окисли-

тельно-восстановительного статуса (Orr et al., 2005). Повышение

продукции активных форм кислорода вызывает сдвиг в окисли-

тельно-восстановительном статусе клетки, который определяется

количеством и соотношением взаимозаменяемых форм окисли-

тельно-восстановительных пар, таких как дисульфиды GSH, цис-

теин, тиоредоксин, NAD(P)H и NAD(P)

. Концентрация глута-

тиона в клетке на 2—3 порядка выше, чем любого другого анти-

окислителя. Он является главным детерминантом и индикатором

общего окислительно-восстановительного статуса. Однако кон-

центрация GSH зависит от нескольких факторов, в том числе от

наличия предшественников и от темпов синтеза и окисления. Кон-

центрация метионина может также влиять на состояние глута-

тиона, поскольку он является предшественником в биосинтезе

цистеина (Rebrin et al., 2004). Окисление GSH, цистеина и ме-

тионина — наиболее ранние клеточные ответы на увеличение

выработки активных форм кислорода. Последствием увеличения

продукции свободных радикалов является обратимое окисление

белковых цистеинил-тиолов, приводящее к формированию сме-

шанных протеин-глутатионил-дисульфидов с GSH и его метабо-

216

литами (протеин-цистеинилом и протеин-цистеинил-глицином).

Тиолирование потенциально служит регулирующим механизмом

активации/инактивации белков, вовлеченных в разнообразные

функции, такие как трансдукция сигнала, активация генов и фер-

ментов (Rebrin et al., 2004).

Темпы образования митохондриями свободных радикалов,

супероксид-анион радикала (O

–

) и перекиси водорода (H

) уве-

личиваются с возрастом и отрицательно коррелируют с макси-

мальной продолжительностью жизни, по крайней мере у млеко-

питающих и насекомых (Bayne et al., 2005). Прямые экспери-

менты по влиянию окислителей на скорость старения в целом

подтверждают теорию Хармана. Например, мухи, обработанные

паракватом (реагентом, вызывающим оксидативный стресс), ха-

рактеризуются нарушениями циклов сон : бодрствование, сход-

ными с наблюдаемыми при старении (Koh et al., 2006). У дрозо-

филы старение и оксидативный стресс-ответ одинаково сверхэкс-

прессируют гены биосинтеза пуринов, белков теплового шока,

антиоксидантов и гены врожденного иммунного ответа. При этом

одинаково подавляется активность субъединиц протеосомы и дру-

гих протеаз (41 ген), щелочных фосфатаз (8 генов) и триацилгли-

цероловых липаз (4 гена). В конечном счете при старении и окси-

дативном кислородном стрессе перекрывается экспрессия 38 %

генов (Landis et al., 2004). Дефект митохондриального фермента

β-субъединицы сукцинатдегидрогеназы у дрозофилы обусловли-

вает гиперчувствительность к кислороду и появление признаков

прогероидного синдрома (раннее начало смертности и прежде-

временное угасание поведенческих реакций). Все эти наруше-

ния являются следствием повышенной выработки митохондрия-

ми H

(Walker et al., 2006а).

Возрастзависимое увеличение содержания оксидативно по-

врежденных нуклеиновых кислот, белков и липидов отмечено в

различных тканях у многих видов животных. В мозгу человека и

других млекопитающих старение ассоциировано с увеличением

окислительного повреждения как митохондриальной, так и ядер-

ной ДНК, причем в митохондриальной ДНК уровень повреждений

значительно выше, поскольку она ближе к основному источнику

образования свободных радикалов. Оксидативное повреждение

ядерной ДНК обусловливает возникновение разрывов цепей, спо-

собных вызвать гибель клетки или мутации, нарушающие синтез

белков и приводящие к клеточной дисфункции (Martin, Grotewiel,

2006).

Высокое потребление кислорода постмитотическими клетка-

ми повышает риск накопления оксидативных повреждений ДНК,

особенно в промоторных областях генов нейронов. Промоторные

217

участки генов особенно уязвимы, так как они содержат GC-бога-

тые последовательности, которые очень чувствительны к повреж-

дению и не защищены эксцизионной репарацией. Основным мо-

дифицированным основанием является 8-оксо-2'-деоксигуанозин.

Повреждение ДНК наблюдалось также и в экзонах, но в меньшей

степени, чем в промоторах. Стабильно экспрессируемые и сверх-

экспрессируемые гены стареющего кортекса демонстрируют не-

большое число повреждений ДНК в своей промоторной облас-

ти. Напротив, большинство генов с возрастзависимым снижением

регуляции имеют значительно большее число повреждений. Та-

ким образом, повреждение ДНК может снижать экспрессию наи-

более уязвимых генов, вовлеченных в обучение, память и нейро-

нальное выживание, инициируя программу старения мозга, на-

чинающегося у человека после 40 лет (Lu et al., 2004; Englander,

Ma, 2006).

Белки получают оксидативные повреждения аминокислот и

кофакторов. Остатки метионина особенно чувствительны к оки-

слению активными формами кислорода, образуя метионин-S- и

метионин-R-сульфоксиды (Koc et al., 2004). Ключевой митохонд-

риальной мишенью оксидативного повреждения служит фермент

аконитаза (Bitterman et al., 2003). До одной трети белков мозга у

пожилых индивидуумов оксидативно повреждены, а их функцио-

нирование снижается (Fraser et al., 2005). У мышей возрастзависи-

мое снижение способности к скоординированным движениям так-

же связано с окислением белков в мозжечке (Martin, Grotewiel,

2006). Оксидативное повреждение белков увеличивается с возрас-

том у дрозофилы, в гепатоцитах крыс, в мозгу собаки, в хрустали-

ке глаза человека. Карбонилирование белков в гепатоцитах крыс и

хрусталике человека свидетельствует о том, что у старого организ-

ма около 30 % общего белка клетки может быть оксидативно по-

врежденным, по крайней мере в некоторых тканях (Martin, Grote-

wiel, 2006). Одна из эволюционных теорий старения предполагает,

что симметрично делящиеся организмы не стареют. Однако это

противоречит экспериментальным данным. Иммунофлуоресцент-

ный анализ на наличие карбонилированных белков в симметрич-

но делящихся клетках дрожжей Schizosaccharomyces pombe де-

монстрирует постепенное накопление со временем таких белков.

При делении окисленные белки распределяются между двумя

дочерними клетками. Тем не менее количество молодых клеток

(т. е. содержащих мало окисленных белков) остается достаточно

большим, чтобы обеспечить выживание популяции (Minois et al.,

2006).

Карбонилирование возникает через прямое окисление опреде-

ленных боковых цепей аминокислот и оксидативно-индуцирован-

218

ного разложение пептидов. В норме такая модификация метит

ферменты для деградации цитозольными нейтральными щелоч-

ными протеазами или протеосомой. Однако темп белкового обме-

на с возрастом снижается, что может приводить к накоплению по-

врежденных белков в стареющей клетке (Tavernarakis, Driscoll,

2002).

Липиды являются важным повсеместным компонентом био-

логических мембран, и их модификация окислительными про-

цессами может влиять на текучесть и проницаемость мембран и

инактивировать мембраносвязанные белки, обусловливая эффек-

ты старения. Окислительные повреждения липидов возникают

при автокаталитических реакциях перекисного окисления. Фосфо-

липиды в наиболее метаболически активных тканях, таких как пе-

чень, в особенности фосфолипиды митохондриальных мембран

как наиболее близкие к месту образования активных форм кисло-

рода, подвергаются наибольшему риску повреждения. Чувстви-

тельность мембран к перекисному окислению липидов зависит от

их качественного состава. Так, мембраны с большим количеством

полиненасыщенных жирных кислот и особенно ω3-полиненасы-

щенных жирных кислот (докозагексаеновой кислоты) особенно

подвержены оксидативному стрессу (Andziak, Buffenstein, 2006;

Martin, Grotewiel, 2006). Пероксиды распадаются до цитотоксич-

ных альдегидов, таких как малоновый диальдегид и 4-гидрокси-

ноненал. Накопление 4-гидроксиноненала увеличивается с воз-

растом в некоторых тканях дрозофилы, а уровень малонового ди-

альдегида и конъюгированного с гидроксиноненалом коллагена

возрастает при старении крыс (Martin, Grotewiel, 2006).

Состав мембран изменяется при ограничении диеты, при этом

происходит снижение накопления повреждений липидов (And-

ziak, Buffenstein, 2006). Клеточное окружение влияет на окисле-

ние липидов, модулируя количество повреждений. Переходные

металлы, такие как железо, инициируют реакцию Фентона, со-

провождающуюся образованием высокоактивных гидроксил- и

алкоксил-радикалов. Возрастзависимые изменения внутриклеточ-

ной концентрации железа могут влиять на скорость окислитель-

ных процессов и на накопление повреждений. Действительно, уве-

личение концентрации железа с возрастом коррелирует с уве-

личением оксидативных повреждений у крыс и мышей. Однако

результаты исследований возраст-ассоциированных изменений

количества поврежденных липидов противоречивы и зависят от

ткани и вида, что даже привело к заключению о том, что посте-

пенное окислительное повреждение липидов не является интег-

ральным показателем старения организма (Andziak, Buffenstein,

2006).

219

Признаком старения у нематод и других животных служит

аутофлуоресценция клеток в результате лизосомального накопле-

ния липофусцина — неперевариваемого продукта оксидативной

деградации и автофагоцитоза клеточных компонентов (Garigan

et al., 2002).

Оксидативный стресс влияет на выживание клеток и гомео-

стаз. Он запускает изменение экспрессии генов, приводящее либо

к клеточному старению, либо к апоптозу, либо к восстановлению

клетки (Lehtinen et al., 2006). Преждевременное старение клеток

в культуре индуцируется оксидативным стрессом (Hardy et al.,

2005). Одним из механизмов этого явления может быть образова-

ние одноцепочечных разрывов в теломерной ДНК (Kurz, 2004).

У здоровых женщин предклимактерического возраста, имеющих

детей с хроническими заболеваниями, оксидативный стресс и дли-

на теломер зависели от длительности болезни детей (от 1 до 12 лет)

(Sapolsky, 2004). Снижение концентрации окружающего кисло-

рода значительно увеличивает продолжительность жизни пер-

вичных клеток в культуре. Сходное увеличение достигается по-

полнением уровня антиоксидантов. Например, увеличение уровня

активности супероксиддисмутазы продлевает жизнь первичных

фибробластов, а также снижает темпы укорочения теломер. На-

против, выключение Sod методом РНК-интерференции индуци-

рует клеточное старение через активацию р53 (Balaban et al., 2005).

У мух с доминантно-негативной, т. е. не способной связываться

с ДНК, формой р53, экспрессируемой в нейронах, устойчивость

к индуктору активных форм кислорода параквату возрастала, так

же как и продолжительность жизни (Bauer et al., 2005). Как уже

говорилось ранее, белок р53 в ответ на повреждение ДНК инду-

цирует транскрипцию р21 гена-ингибитора циклин-зависимых

киназ, приводящего к необратимой остановке клеточного цикла.

Сверхактивация р21 повышает уровни активных форм кислорода

как в нормальных, так и в опухолевых клетках, причем пропор-

ционально уровню р21. Ингибитор свободных радикалов NAC

подавляет окрашивание р21-экспрессирующих клеток на старе-

ние-ассоциированную β-галактозидазу и защищает их от необра-

тимой остановки роста, индуцированной р21. Еще один р53-инду-

цируемый ген — PIG3 приводит к индукции свободных радика-

лов (Macip et al., 2002).

Генетические модификации, увеличивающие продолжитель-

ность жизни модельных животных, зачастую повышают их устой-

чивость к окислительному стрессу.

При хронологическом старении дрожжей важная роль принад-

лежит цитоплазматическим и митохондриальным супероксиддис-

мутазам (гены Sodl и Sod2; сверхэкспрессия обоих генов прод-

220