Москалев А.А. Старение и гены

Подождите немного. Документ загружается.

ции рДНК, приводящей к появлению экстрахромосомных колец,

накапливающихся в материнской клетке и вызывающих ее гибель.

Однако ряд наблюдений противоречит этой точке зрения. Напри-

мер, преждевременного накопления колец рДНК не было обна-

ружено как у sgs1-мутантов, так и при нарушении гомологичной

рекомбинации в результате мутаций других генов репарации

(RAD50, RAD51, RAD52 и RAD57). Более того, у клеток, выведен-

ных из состояния стационарной фазы, продолжительность жизни

снижается без появления кольцевых рДНК. Некоторые случаи,

при которых длительность жизни дрожжевой клетки увеличивает-

ся (например, ретроградный ответ при сигналинге из митохондрий

в ядро), также сопровождаются экспоненциальным накоплением

кольцевых рДНК. Таким образом, накопление экстрахромосомных

рДНК не является непосредственной причиной репликативного

старения. По-видимому, мутация гена sgs1 имеет более глубокие

последствия, приводя к систематическим эндогенным поврежде-

ниям ДНК и хромосомным перестройкам, т. е. к нестабильности

генома (Hoopes et al., 2002).

Другая репликативная геликаза/нуклеаза дрожжей — DNA2,

также являющаяся членом семейства RecQ-геликаз, необходима

для нормальной продолжительности жизни. У мутантов dna2 все

фенотипы, присущие старым клеткам (удлинение клеточного цик-

ла, возрастзависимые дефекты транскрипционного сайленсинга,

реорганизация ядрышка), возникают спустя лишь несколько поко-

лений. Однако продолжительность их жизни можно увеличить эк-

спрессией дополнительной копии sir2 или делецией fob1. Мутация

rad27δ в гене гомолога нуклеазы FEN-1 млекопитающих, участ-

вующей в поддержании геномной стабильности, также приводит

к преждевременному старению дрожжей (Hoopes et al., 2002). Бо-

лее того, сверхэкспрессия RAD27 подавляет эффекты мутации

dna2-1. Таким образом, SGS1, DNA2, RAD27 и FOB1 взаимодейст-

вуют в процессе поддержания стабильности генома и репликатив-

ного старения у дрожжей (Lesur, Campbell, 2004).

В настоящий момент все исследователи сходятся во мнении,

что наиболее вероятным фактором, способствующим возникнове-

нию рекомбинаций и ускоренного старения у мутантов дрожжей,

является повреждение ДНК при репликации. При нормальном

старении вероятной причиной репликационных ошибок следует

считать эндогенное оксидативное повреждение ДНК. В итоге воз-

никает генетическая нестабильность — экстрахромосомные коль-

цевые ДНК или потеря гетерозиготности, что обусловливает реп-

ликативное старение (Hoopes et al., 2002; Lesur, Campbell, 2004).

Вышеперечисленные механизмы эволюционно консерватив-

ны. Потеря ортолога RecQ5 у нематоды также вызывает появление

121

чувствительности к повреждению ДНК и укорочение продолжи-

тельности жизни (McColl et al., 2005). Мутации генов некоторых

геликаз млекопитающих служат причиной частичных прогерий

(см. разд. 2.2.2). Частичная потеря функции гена деацетилазы грйЗ

у дрозофилы увеличивает продолжительность жизни (Bitterman

et al., 2003). У млекопитающих один из гомологов деацетилазы

SIR2 дрожжей — SIRT6 принимает участие в эксцизионной ре-

парации оснований и поддерживает целостность генома клетки.

Его потеря у мышей сопровождается старение-ассоциированным

дегенеративным синдромом (Mostoslavsky et al., 2006).

У мышей мутанты, потерявшие функцию супрессора опухолей

BRCA1, характеризуются высокой эмбриональной летальностью,

а также задержкой роста, апоптозом, дефектами репарации ДНК,

амплификацией центромер, потерей проверочной точки G

/M кле-

точного цикла, геномной нестабильностью. Около 40 % наследст-

венного рака груди связано с мутацией гена Brcal. В то же время

отсутствие полнофункционального Brcal приводит к клеточному

старению у мутантных эмбрионов и клеток в культурах, а также к

преждевременному старению взрослых мышей. Преждевремен-

ное старение мышей проявляется в виде снижения продолжитель-

ности жизни, уменьшения отложения жира, остеопороза, атрофии

кожи, ослабления заживления ран. Нарушение функции BRCA1

активизирует р53, что отчасти объясняет наблюдаемые фенотипы.

Эффекты, вызванные отсутствием Brcal, могут быть отменены

потерей самого р53 или его гена-мишени p21. Мутантные клетки,

избежавшие старения, подвергаются клональной селекции на бы-

струю пролиферацию, у них наблюдаются молекулярные измене-

ния, такие как сверхэкспрессия циклина D1и циклина А, а также

потеря p53, что приводит к опухолеобразованию (Cao et al., 2003).

Таким образом, очевидно, что гены, играющие определяющую

роль в поддержании стабильности генома, регулируют продолжи-

тельность жизни не только клеток дрожжей, но и млекопитающих.

Данные механизмы являются эволюционно консервативными.

Исследования, выполеннные на мутантных клетках и организ-

мах, лишь продемонстрировали возможную роль генетической не-

стабильности в старении. Каков главный механизм генетической

нестабильности при естественном старении? Жизнеспособность

организма обеспечивают мощные процессы самоподдержания и

репарации. Например, в каждой клетке человека за день происхо-

дит 30—70 тыс. повреждений ДНК. Возникает необходимость в

значительных энерготратах на производство ферментов репара-

ции (Wright, Shay, 2005а). В молодых клетках спонтанные повреж-

дения ДНК и их репарация сбалансированы. С возрастом снижает-

ся способность к репарации и повреждения накапливаются, вслед-

122

ствие чего и возникает генетическая нестабильность (Wojda, Witt,

2003).

Наиболее опасным типом повреждения ДНК являются двухце-

почечные разрывы. При этом нарушаются сразу обе матрицы, а та-

кое повреждение часто летально для клетки, поскольку восстанов-

ление требует сближения гомологичных хромосом и огромных

энерготрат. Двухцепочечные разрывы ДНК происходят в клетке в

результате оксидативного энергетического метаболизма, мейоза,

репликации ДНК и V(D)J-рекомбинации. Кроме того, они возни-

кают вследствие облучения и других внешних генотоксических

воздействий (Espejel et al., 2004). Наконец, в качестве двухцепо-

чечного разрыва воспринимаются критически укороченные и ли-

шенные покрова белков теломеры. Если повреждение ДНК не ре-

парируется в относительно короткий промежуток времени (не-

сколько дней), то клетки подвергаются стресс-индуцированному

преждевременному старению либо апоптозу (Naka et al., 2004).

Эукариотические клетки имеют два пути репарации двухце-

почечных разрывов — гомологичную рекомбинацию и негомо-

логичное соединение концов. Последний способ наиболее важен

и осуществляется ДНК-зависимой протеинкиназой и комплек-

сом XRCC4/лигазы IV. ДНК-протеинкиназа состоит из гетероди-

мера Ku86/Ku70 и каталитической субъединицы. Гетеродимер Ku

связывается с концами поврежденной ДНК, предотвращая их де-

градацию и стимулируя репарацию. Было показано, что клетки,

дефектные по Ku86 и каталитической субъединице ДНК-зави-

симой протеинкиназы, проявляют хромосомную нестабильность.

Нокаутных мышей по любому из трех компонентов ДНК-протеин-

киназного комплекса отличают иммунодифицит и повышенная

радиочувствительность. Трансгенные мыши с нарушенной ка-

талитической субъединицей характеризуются низкой продолжи-

тельностью жизни и ранним началом связанных со старением па-

тологий по сравнению с животными дикого типа. У них заметно

повышается вероятность случаев Т-лимфом и инфекций. Все это

можно объяснить с позиции участия каталитической субъединицы

ДНК-протеинкиназы в репарации ДНК и поддержании длины те-

ломер (Morgan et al., 1997; Espejel et al., 2004; McColl et al., 2005).

Таким образом, вполне вероятно, что накопление поврежде-

ний ДНК с возрастом может быть связано с наблюдаемым сниже-

нием уровня аутоантигенов Ku (Ku70 и Ku86), ДНК-зависимой

протеинкиназы и PARP (Salminen et al., 1997). Исследование изме-

нения с возрастом уровня экспрессии белков репарации двухцепо-

чечных разрывов Ku70, Mre11, Sir2, TRF1 и Ku80 в лимфоцитах

показало заметное снижение лишь Ku70 и Mre11. Кроме того, экс-

прессия Ku70 выше у долгожителей (Ju et al., 2006). В гепатоцитах

123

пожилых крыс удаление УФ-индуцируемых повреждений в актив-

но транскрибируемых участках генома ниже по сравнению с моло-

дыми животными, что предполагает снижение с возрастом в ядре

репарации, связанной с транскрипцией (Souza-Pinto et al., 1999).

Дефекты репарации и, как следствие, повреждение ДНК могут

обусловливать старение путем снижения количества функциона-

льных стволовых клеток. Такие нарушения для гематопоэтиче-

ских клеток наблюдаются у мышей с дефектами генов репарации

(Atr, FANCD1, MSH2, ERCC1, Ku80, XPD, mTERC) или с гипомор-

фной аллелью ДНК-лигазы IV. Мыши с мутацией фермента репа-

рации RAD50, входящего в состав MRE11-комплекса, проявляют

гипоплазию костного мозга. При нормальном старении гематопоэ-

тические стволовые клетки характеризуются также проявлениями

повреждения ДНК (под микроскопом обнаруживаются скопления

гистона H2AX). Несмотря на то что такие стволовые клетки не

прекращают пролиферировать, они часто подвергаются апоптозу

(Sharpless, DePinho, 2007).

Одним из возможных проявлений нестабильности является

возрастзависимое изменение экспрессии генов. Транскрипцион-

ный профиль фронтального кортекса человека при старении де-

монстрирует начало изменения транскрипции ряда генов уже по-

сле 40 лет. Причем уровень повреждений ДНК (накопление 8-ок-

согуанина) наиболее заметно увеличивается в промоторах именно

тех генов, экспрессия которых снижается с возрастом. Промо-

торные участки генов особенно уязвимы, так как они содержат

GC-богатые последовательности, которые очень чувствительны к

оксидативному повреждению и не защищены репарацией, свя-

занной с транскрипцией. Таким образом, большее количество ис-

ходных повреждений и более медленная эксцизионная репарация

оснований отдельных промоторов могут вносить вклад в окси-

дативное повреждение генов, приводя к снижению их экспрессии

и к дисфункции клеток. Увеличение оксидативного поврежде-

ния ДНК в стареющем кортексе сопровождается сверхэкспрес-

сией ферментов эксцизионной репарации 8-оксогуанин-ДНК-гли-

козилазы и урацил-ДНК-гликозилазы (Lu et al., 2004). Кроме того,

в постмитотическом мозгу в 1.5—2 раза усиливается активность

ферментов эксцизионной репарации гликозилаз NEIL1 и NEIL2,

тогда как уровень мРНК других гликозилаз, например OGG1 и

APE1, снижается (Englander, Ma, 2006). Таким образом, при старе-

нии имеет место воспроизводимое подавление активности одних

генов (в результате нарушений в их промоторах или в рамках адап-

тивного ответа) при компенсаторной активации других.

Теория соматических мутаций выдвигает на роль главной при-

чины старения накопление устойчивых нарушений генов в сома-

124

тических клетках, а в качестве важнейшего их источника рас-

сматривает свободные радикалы (Weinert, Timiras, 2003). Действи-

тельно, изменения в генетическом материале на уровне генов и

хромосом в соматических и половых клетках почти всегда вред-

ные, снижающие приспособленность и здоровье организма. На-

пример, большинство рецессивных мутаций, даже в гетерозиготе,

снижает приспособленность у дрозофилы на 1—2 %, причем та-

кие мутации синергетически взаимодействуют, что усугубляет их

вред. Накопление генов с отсроченными эффектами увеличивает

генетическую нестабильность соматических клеток. С возрастом

в клетках организма увеличивается число генных мутаций, собы-

тий хромосомных разрывов, транспозиций ДНК, изменений пар

оснований микро- и минисателлитных повторов, окислительных

повреждений ДНК, нерасхождений хромосом, повреждений ми-

тохондриальной ДНК. Одновременно происходит снижение спо-

собности репарировать ДНК, эффективности ДНК-полимеразы и

уровня рекомбинации, а также количества ловушек свободных

радикалов и длины теломер. Теория соматических мутаций под-

тверждается и тем, что агенты, индуцирующие мутации или повы-

шающие скорость мутирования, также снижают продолжительность

жизни (химические и физические мутагены, стрессы, дефекты

антиоксидантной защиты, подавление функции опухолесупрес-

соров) (Woodruff, Thompson, 2003).

Приведем несколько примеров, подтверждающих теорию со-

матических мутаций. С возрастом увеличивается количество кле-

ток, которые накапливают хромосомные аберрации в результате

нарушения репарации в G

-фазе клеточного цикла. В ряде иссле-

дований было показано возрастзависимое увеличение хромосом-

ных потерь — гипоплоидии (преимущественно половых хромо-

сом, Х-хромосомы у женщин и Y — у мужчин) и анеуплоидии в

периферических лимфоцитах и фибробластах кожи. Кроме того,

FISH-анализ интерфазных ядер у человека показал значительное

увеличение с возрастом доли анеуплоидных клеток с потерян-

ными аутосомами 1, 4, 6, 8, 10 и 15. Многие из этих хромосом не-

сут гены продолжительности жизни или синдромов преждевре-

менного старения. Вполне возможно, что степень и тип анеуплои-

дии могут обусловливать влияние дозы таких генов на контроль

клеточной пролиферации при старении. Частота анеуплоидии на-

прямую связана с образованием микроядер. Дисфункции кине-

тохоры и центромеры способны вызывать отставание целых хро-

мосом или хромосомных фрагментов в анафазе. В результате в

телофазе формируются микроядра, обнаруживаемые в цитоплаз-

ме дочерних клеток как малые дополнительные ядра. Этот про-

цесс усиливается с возрастом. В результате клетки пожилых инди-

125

видуумов содержат в 3 раза больше микроядер, чем клетки мо-

лодых. В то же время такие клетки редко способны долго под-

держивать свою жизнеспособность. Стабильные цитогенетические

повреждения накапливаются с возрастом в значительно большей

степени: транслокации и инсерции возрастают 10-кратно, дру-

гие хромосомные нарушения — дицентрики и ацентрики с воз-

растом учащаются 3-кратно (Wojda, Witt, 2003). Среди соматиче-

ских мутаций, происходящих в результате стохастических собы-

тий и принимающих участие в старении клеток, выделяют также

ретротранспозиции элемента LINE-1 (long interspersed nuclear ele-

ment-1), точечные мутации в микроРНК, сегментные дуплика-

ции и неполное доминирование (гаплонедостаточность) (Martin,

2005).

У противников теории соматических мутаций также есть свои

аргументы. Например, несмотря на то что рентгеновское облуче-

ние снижает продолжительность жизни гаплоидных ос (Habrobra-

con) больше, чем диплоидных, нормальная продолжительность

жизни этих двух разновидностей ос одинакова. Это якобы доказы-

вает несущественную роль мутированных соматических генов в

старении. Однако у гаплоидных особей во многих тканях отмече-

ны экстрахромосомы, дублирующие важную информацию (поли-

плоидия) (Woodruff, Thompson, 2003), что не позволяет делать

столь глобальные выводы из данного эксперимента.

Согласно теории накопления соматических мутаций, клониро-

вание особей с использованием ядер старых клеток должно вести

к снижению продолжительности жизни по сравнению с использо-

ванием ядер более молодых клеток (Woodruff, Thompson, 2003).

Действительно, мыши и сельскохозяйственные животные, клони-

рованные из соматических клеток, часто имеют сниженную про-

должительность жизни и большинство таких животных нездоро-

вы — подвержены пневмониям и нарушениям функции печени

(Kato et al., 1998; Ogonuki et al., 2002). Тем не менее в одном из экс-

периментов мыши, клонировавшиеся путем переноса соматиче-

ского ядра в течение шести поколений, не проявляли признаков

преждевременного старения, оцениваемого по поведенческим па-

раметрам (Wakayama et al, 2000). Возможно, это связано с тем, что

у мышей отсутствует репликативное старение. Как обсуждалось в

предыдущем разделе, модель клонированных животных дает про-

тиворечивые результаты и при оценке роли укорочения теломер в

старении организма.

Старение также сопровождается глобальным эпигенетическим

сдвигом. Исследование возраст-ассоциированной активации эпи-

генетически подавляемых генов в тканях стареющих мышей по-

казало, что их на 2 порядка больше, чем соматических мутаций.

126

Известен сдвиг гетерогенности клеточных популяций в тканях

млекопитающих при старении (Martin, 2005). Современная моле-

кулярная генетика указывает на два класса возрастзависимых эпи-

генетических изменений: метилирование цитозина в CpG-дину-

клеотидах и ковалентная модификация ДНК-связанных гистонов,

в особенности ацетилирование и метилирование. Метилирование

цитозинов в CpG богатых островках промоторов генов обычно

связано с подавлением активности, тогда как ацетилирование ги-

стонов — с генной активацией (Martin, 2005). Наиболее заметным

эпигенетическим изменением, сопровождающим старение, являет-

ся постепенная потеря 5-метилцитозина в регуляторных участках

генов и в повторяющихся последовательностях (Бердышев и др.,

1967; Ванюшин, Бердышев, 1977; Oakley, Van Zant, 2007). Сниже-

ние количества 5-метилцитозина в геномной ДНК наблюдается

как в стареющих культурах клеток, так и in vivo. Обработка кле-

точных культур ингибиторами ДНК-метилтранфераз сокращает

продолжительность их жизни по сравнению с контролем. Гипоме-

тилирование ведет к фенотипическим проявлениям клеточного

старения, сопровождающимся повышенной экспрессией опухо-

лесупрессоров p16

INK4a

и p21 (Sun et al., 2004).

Показано, что делеция PASG (proliferation associated SNF-2-like

gene), гена геликазы SNF2-подобного фактора, способствующего

метилированию ДНК, вызывает глобальное гипометилирование,

задержку роста и развития и фенотип преждевременного старе-

ния. Мыши с данным дефектом отличаются низкой массой тела

при рождении, быстро седеют и теряют волосы, имеют слабую

прослойку подкожного жира, отличаются предрасположенностью

к остеопорозу, кифозу, кахексии и преждевременной гибели. Фиб-

робласты из эмбрионов этих мутантов проявляют фенотип репли-

кативного старения. У них заметно выше экспрессия ассоцииро-

ванного со старением гена p16

INK4a

, что связано с низкой экс-

прессией bmi-1 — негативного регулятора p16. Таким образом,

не вызывает сомнений, что метилирование ДНК через изменение

генной экспрессии задействовано в процессах старения (Sun et al.,

2004).

Тогда как молодые монозиготные близнецы практически неот-

личимы по эпигенетическим маркерам, старые близнецы проявля-

ют значительные вариации. Так, обнаружены глобальные и ло-

кус-специфичные различия метилирования ДНК и ацетилирова-

ния гистонов. Различия в экспрессии генов у старых пар близнецов

в 4 раза больше, чем у молодых (Martin, 2005). В норме одна из

Х-хромосом в женских соматических клетках инактивирована пу-

тем гиперметилирования. С возрастом наблюдается реактивация

генов в «выключенной» Х-хромосоме (Barbot et al., 2002). Возраст-

127

зависимое гипометилирование ДНК может вносить вклад в хромо-

сомную нестабильность, вести к активации онкогенов и увеличе-

нию частоты опухолей с возрастом. Особенно велика вероятность

данных событий в долгоживущих, стволовых, клетках (Oakley,

Yan Zant, 2007).

Ретротранспозон IAP (intracisternal A-particle), являющийся

членом большого семейства строго подавляемых мобильных

элементов, активируется с возрастом. Это становится возможным

благодаря деметилированию промотора данного транспозона,

отмеченному, например, в печени старых мышей. Неконтроли-

руемые перемещения IAP могут вызывать дестабилизацию гено-

ма, тем более что он представлен в геноме мышей в количестве

1000 копий. Деметилирование также необходимо для индукции

эндогенных ретровирусов MuLV и MMTV у стареющих грызунов.

Их инсерция вызывает различные мутации, включая активацию

генов-мишеней благодаря энхансерному эффекту. Это может слу-

жить причиной эпигенетических и стохастических процессов, та-

ких как включение или выключение различных генов, и вызывать

старение клетки (Barbot et al., 2002).

Таким образом, экспоненциальное увеличение количества

транспозонов в геноме может быть причиной инактивации су-

щественных генов и приводить к гибели клеточной линии или ор-

ганизма в целом, т. е. транспозоны могут быть причиной старе-

ния (Murray, 1990). Корреляция между старением и активностью

транспозирующихся элементов проанализирована на разнообраз-

ных биологических системах (Nikitin, Shmookler Reis, 1997).

Количество эксцизий элемента Tc1 на сайт у нематоды Caenor-

habditis elegans возрастает более чем в 14 раз на протяжении жиз-

ни этого организма (Egilmez, Shmookler Reis, 1994). В регуляцию

продолжительности жизни особей данного вида вовлечены транс-

позаза и ретротранспозон-интеграза. Исследования показали, что

транспозаза относится к числу генов, чья экспрессия увеличивает-

ся при старении, а это может приводить к геномной нестабиль-

ности (Hamilton et al., 2006). В то же время гены транспозазы высо-

коэкспрессированы и у долгоживущих личинок dauer, и у мутан-

тов daf-2, что должно приводить к общей активации транспозиций.

Хотя транспозиции не сопровождаются увеличением продолжи-

тельности жизни, а скорее наоборот, у долгоживущих червей они

могут быть следствием изменения структуры хроматин, например

отклонения от нормы соотношения разных гистоновых белков.

У имаго daf-2 уровень гистонов H2 снижен, а Н4 повышен (McEl-

wee et al., 2004).

Соматически активный Ð-элемент значительно снижает про-

должительность жизни, половую и физическую активность дрозо-

128

фил. Рекомбинации между повторяющимися последовательностя-

ми мобильных элементов в соматических клетках могут вести к

перестройкам ДНК. Соматические перемещения Р-элементов у

Drosophila melanogaster и тяагшег-элементов у D. simulans зна-

чительно снижают продолжительность жизни самцов. У D. mela-

nogaster происходит лог-линейное снижение продолжительности

жизни с увеличением количества активных Р-элементов. Переме-

щение даже одного соматически активного Р- или mariner-эле-

мента приводит к значительному снижению продолжительности

жизни (Woodruff, 1992; Woodruff, Nikitin, 1995; Woodruff et al.,

1999). Транспозоны могут участвовать в процессе старения че-

рез соматические мутации. Установлено, что по крайней мере два

ретротранспозона у дрозофилы (Copia и 412) имеют соматиче-

скую активность во взрослых тканях (Driver, McKechnie, 1992).

Кроме того, для Copia показано значительное повышение с воз-

растом уровня транспозиций в гаметах (Filatov, Morozova, 1998).

Таким образом, индукцию транспозиций можно считать одной

из причин возрастной нестабильности генома и клеточного ста-

рения.

Таким образом, старение связано со снижением способности

поддерживать и репарировать геном соматических клеток. Деста-

билизация генома, накопление соматических мутаций и эпигене-

тических изменений могут обусловливать изменение экспрессии

генов, являющееся причиной возрастзависимого нарушения кле-

точных функций. Кроме того, нестабильность генома может слу-

жить причиной увеличения частоты возникновения рака с воз-

растом.

2.2.2. Синдромы преждевременного старения

Одним из подходов к изучению молекулярных основ

старения человека является выяснение причин заболеваний преж-

девременного старения — так называемых частичных прогерий.

В большинстве своем они моногенны, а значит, легко поддаются

анализу. К недостаткам данного подхода можно отнести редкость

таких заболеваний и то, что иногда их симптомы лишь напомина-

ют свойства нормального старения (Scaffidi et al., 2005). Опреде-

ленные мутации у человека (табл. 9), вызывающие нарушение ста-

бильности генома, приводят к таким заболеваниям, связанным с

признаками преждевременного старения, как синдромы Вернера,

Кокейна, Дауна и Хатчинсона—Джилфорда, пигментная ксеро-

дерма, анемия Фалькони, синдромы Ротмунда—Томпсона (RTS),

Блума, поломок Ниджмеджена (Nijmegen breakage syndrome —

129