Лысак В.В. Микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

229

- образование эффективных конъюгационных пар;

- перенос генетического материала из донорных клеток в реци-

пиентные клетки;

- постконъюгационный синтез донорной ДНК в реципиентной

клетке;

- гомологичная рекомбинация перенесенного фрагмента донорной

ДНК с ДНК реципиентной клетки.

Применение конъюгации:

1. В процессе конъюгации можно передавать из одних клеток в

другие клетки многие генетические маркеры. Показано, что при

конъюгации вся хромосома бактерий E.coli передается за 100 минут. В

«мягких» условиях можно добиться переноса всей хромосомы и даже

повторной передачи хромосомы по механизму «котящегося кольца»

или «разматывающегося рулона», если в хромосоме нет профага.

2. Метод конъюгационного скрещивания удобен для картирования

хромосомы. Карта хромосомы у бактерий строится в минутах. У бак-

терий E.coli началом карты (0 мин) являются точки локализации ге-

нов, ответственных за синтез треонина и лейцина.

3. Конъюгация используется для изучения генетического аппарата

у бактерий.

4. Конъюгация имеет место в природе и поэтому она является

важным фактором изменчивости бактерий.

7.5.3. Трансдукция

Трансдукция была открыта в 1952 году, после того как была уже

описана трансформация у пневмококков и конъюгация у бактерий

E.coli.

Циндер Н., будучи ещё студентом, работал в лаборатории Е.Ле-

дерберга. Он пытался обнаружить конъюгацию у бактерий Salmonella

typhimurium. В его распоряжении было 20 моноауксотрофных штам-

мов S. typhimurium. Циндер Н. смешивал эти штаммы попарно в раз-

личных комбинациях и пытался выявить прототрофное потомство. В

результате в 9 случаях из 79 исследованных комбинаций с частотой

-5

– 10

-6

он выявил прототрофные клоны. Поскольку исходные

штаммы на минимальной среде не давали ревертантов, то Н.Циндер

сделал вывод, сто между штаммами S.typhimurium осуществляется

конъюгация, при которой происходит передача наследственной ин-

формации. Для подтверждения этого Н.Циндер и Е.Ледерберг пов-

торили опыт Б.Дэвиса с U-образной пробиркой, разделенной стеклян-

230

ным фильтром, не пропускающим бактериальные клетки. В опыте ис-

пользовались 2 штамма бактерий S. typhimurium:

S. typhimurium 2A his

и S. typhimurium 22 A trp

В одну ветвь U-образной пробирки вносили культуру штамма 22А

в концентрации 1

клеток/мл, в другую ветвь такое же количество

клеток штамма 2А. После определенного периода инкубации в ветви

пробирки, в которую были внесены клетки штамма 22А, Н.Циндер и

Е.Ледерберг обнаружили прототрофные клетки с частотой 1

-5

. В

той ветви пробирки, в которую были внесены клетки штамма 2А, про-

тотрофы отсутствовали (рис. 68).

Рис. 68. Схематическое изображение классического опыта Н.Циндера и

Е.Ледерберга

Полученные результаты не подтвердили предположение Н.Цинде-

ра и Е.Ледерберга о конъюгационном переносе наследственной ин-

формации у штаммов 2А и 22А S. typhimurium. Последующая провер-

ка этих штаммов показала, что штамм 22А загрязнен фагом Р22. Этот

фаг способен инфицировать и лизировать клетки штамма 2А. После

проникновения через стеклянный фильтр этот фаг инфицировал клет-

ки штамма 2А, репродуцировался и лизировал их. При этом освобож-

дался фильтрующийся агент (ФА) (так его называли Н.Циндер и

Е.Ледерберг). Он в свою очередь проникал через стеклянный фильтр.

Под влиянием ФА некоторые клетки штамма 22А приобретают спе-

штамм 22 А штамм 2 А

бактериальный фильтр

минимальная

глюкозо-солевая среда

минимальная

глюкозо-солевая среда

231

цифические наследственные свойства, характерные для того штамма

(штамма 2А), из которого выделялся ФА – способность синтезировать

триптофан. Было установлено, что активность агента, способного к

фильтрации (ФА), не утрачивается при обработке его ДНКазой. Зна-

чит это не трансформация. Вместе с тем показано, что свойства

фильтрующегося агента идентичны свойствам фага Р22. Был сделан

вывод, что фаг Р22 переносит наследственную информацию от клеток

штамма 2А в клетки штамма 22А.

Явление переноса генетической информации от клетки-донора к

клетке-реципиенту с помощью фага было названо трансдукцией.

Трансдукция основана на том, что в процессе размножения фагов

в бактериях могут образовываться фаговые частицы, которые наряду с

фаговой ДНК или вместо нее содержат фрагменты бактериальной

ДНК. Такие фаговые частицы называются трансдуцирующими. По

морфологии и адсорбционным свойствам они ничем не отличаются от

обычных фаговых вирионов, но при заражении ими новых клеток, пе-

редают генетические детерминанты предыдущего хозяина. Таким об-

разом, чтобы осуществить трансдукцию необходимо размножить фаг

на клетках штамма-донора, а затем заразить полученным фаголизатом

клетки-реципиента. Отбор трансдуктантов проводят на селективных

средах, где не могут расти исходные реципиентные клетки (рис. 69).

Рис. 69. Схема опыта по трансдукции

232

Изучение трансдукции показало, что одни фаги могут переносить

разные бактериальные гены, а другие – только определенные гены. В

соответствии с этим трансдукцию принято делить на:

- генерализованную (неспецифическую или общую);

- ограниченную или специфическую.

При генерализованной трансдукции может трансдуцироваться лю-

бой бактериальный ген примерно с одинаково высокой частотой. При

специфической трансдукции могут переноситься строго определенные

фрагменты ДНК.

В осуществлении генерализованной трансдукции бактериальный

вирус является только переносчиком генетического материала бакте-

рий. При специфической трансдукции вирус включает ДНК бактерий

в свой геном и передает ее, лизогенизируя бактерии-реципиенты.

Разберем как осуществляется генерализованная и специфическая

трансдукция.

7.5.3.1. Генерализованная трансдукция

Одним из умеренных бактериофагов, осуществляющих общую или

неспецифическую трансдукцию, является уже упоминаемый нами фаг

Р22 S. typhimurium, с которым работали Н.Циндер и Е.Ледерберг.

Следовательно, эти ученые открыли неспецифическую трансдукцию.

К фагам, осуществляющим общую трансдукцию относятся также фа-

ги: P1 E.coli, PBS1 B.subtilis и другие.

Генерализованная трансдукция обеспечивается дефектными части-

цами фагов. Образование таких частиц происходит в ходе репродук-

ции фагов, сопровождающейся распадом бактериальной хромосомной

ДНК. Следует отметить, что образование их может происходить как

при литическом развитии фага (фаги Р22 S. typhimurium и P1 E.coli),

так и после индукции профага ( фаг P1 E.coli). При этом часть фаго-

вых оболочек начинает упаковываться не фаговой, а бактериальной

ДНК. Размеры фрагментов бактериальной ДНК, включающейся в та-

кие частицы, не превышают объем головки, т.е. упаковаться может

столько сколько вмещает головка фага. Упаковываться в фаговые го-

ловки могут самые разнообразные фрагменты бактериальной хромо-

сомы.

Если полученным фаголизатом, содержащим как нормальные, так

и дефектные частицы, обработать клетки штамма-реципиента, то за-

ражение их нормальным фагом ведет, как правило, к лизису клеток.

Однако некоторые клетки инфицируют дефектные трансдуцирующие

фаги. В клетки поступают короткие фрагменты двунитевой ДНК до-

233

нора. Циркуляризации бактериальной ДНК при этом не происходит,

т.е. в рекомбинацию с ДНК реципиента вступают линейные фрагмен-

ты ДНК донора. Рекомбинация, происходящая при общей трансдук-

ции, находится под контролем recA-гена, т.е. это общая гомологичная

рекомбинация, осуществляемая путем реципрокного обмена соответ-

ствующими гомологичными участками. Возникают рекомбинанты,

называемые трансдуктантами. Трансдуктанты нелизогенны и не обла-

дают иммунитетом к фагам, так как трансдуцирующие частицы, вы-

звавшие образование их, не содержат фаговой ДНК (рис. 70).

При генерализованной трансдукции переносится может любой бак-

териальный признак с частотой 10

-5

–10

-6

. Количество бактериальной

ДНК, которое может переносится фагом обычно составляет 1

–2 % от

всего количества ДНК, содержащегося в клетке. Исключение состав-

ляет бактериофаг РBS1 B.subtilis, который может трансдуцировать до

8% генома хозяина.

Однако при общей или генерализованной трансдукции могут воз-

никать не только истинные рекомбинанты-трансдуктанты, в которых

привнесенный ген наследуется стабильно из поколения в поколение

оно

аголизат

ипиент

анс

ду

ктант

Рис. 70. Схема общей трансдукции

234

(полная или завершенная трансдукция), но и абортивные трансдуктан-

ты. При абортивной или незавершенной трансдукции внесенный де-

фектным фагом фрагмент бактериальной хромосомной ДНК донора

не рекомбинирует с хромосомной ДНК реципиентной клетки. Нахо-

дясь в реципиентной клетке привнесенный ген экспрессируется, что

придает клетке новый фенотип, например, приобретение клеткой-

реципиентом способности синтезировать какую-то аминокислоту.

Однако ген экзогеноты (привнесенный ген) не способен реплициро-

ваться. Вследствие этого при делении клетки он передается только

одной из дочерних особей, но во второй клетке еще остается белок –

продукт экспрессии привнесенного гена. Поэтому эта клетка в какой-

то мере сохраняет привнесенный фенотип. С ростом числа делений

идет разведение данного продукта, поэтому абортивные трансдуктан-

ты на селективной среде формируют микроколонии по сравнению с

колониями истинных трансдуктантов. Такие микроколонии абортив-

ных трансдуктантов содержат только одну клетку, несущую экзогено-

ту или привнесенный фагом ген донорной ДНК (рис. 71).

Впервые абортивную трансдукцию обнаружили при передаче ге-

нов, ответственных за жгутикообразование, по образованию на пита-

тельной среде «ползущих следов» или шлейфов. При исследовании

под микроскопом таких клонов оказалось, что жгутик, а следователь-

но подвижность, сохраняет одна клетка. При посеве таких клонов в

малоплотную (полужидкую) питательную среду клетки растут по

уколу и появляется в среде волнистая структура («шлейф», «ползущий

след»): подвижная клетки передвигается, делится и по дороге оставля-

ет неподвижное потомство.

Установлено, что соотношение между завершенной и абортивной

трансдукцией примерно равно 1:10, т.е. абортивная трансдукция про-

исходит чаще чем полная завершенная.

Рис. 71. Абортивная

трансдукция

235

7.5.3.2. Специфическая трансдукция

Специфическая трансдукция была открыта в 1956 году М.Морзе и

супругами Е. и Дж.Ледерберг. Характерной особенностью специфи-

ческой трансдукции является то, что каждый специфически трансду-

цирующий фаг передает только определенную, весьма ограниченную

область бактериальной хромосомы. Если в генерализованной транс-

дукции фаг выступает в качестве «пассивного» переносчика генетиче-

ского материала бактерий, а генетическая рекомбинация у трансдуци-

руемых бактерий происходит по общим закономерностям рекомбина-

ционного процесса, то при специфической трансдукции фаг не только

переносит генетический материал, но и обеспечивает его включение в

бактериальную хромосому.

Наиболее известным примером специфической трансдукции явля-

ется трансдукция, осуществляемая фагом λ, который способен зара-

жать клетки бактерий E.coli (рис. 72).

Рис. 72 . Включение профага λ в хромосому E.coli

Примечание: А – кольцевая хромосома (ДНК) вегетативного фага λ и бактери-

альная хромосома E.coli. 1,2,3,4,5 – условно обозначенные гены фага λ; bio; attλ;

gal - бактериальные гены; Б – синапс, образуемый между фаговой и бактериаль-

ной хромосомой в области бактериального гена attλ ; В – разрыв хромосомы фага

в точке между генами 1 и 5 (область b

) и разрыв хромосомы бактерий в области

236

attλ. Возникновение кроссинговера между хромосомой фага и бактерии; Г – обра-

зование непрерывной генетической структуры, в которой встроена ДНК фага.

Умеренный фаг λ при лизогенизации бактерий встраивается в их

хромосому только в одном месте на участке между локусами gal и bio

в результате сайт-специфической рекомбинации (разрыв и перекрест-

ное воссоединение цепей ДНК). Этот участок получил название attλ.

Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы при индукции профага

осуществляется также по механизму сайт-специфической рекомбина-

ции.

Сайт-специфическая рекомбинация происходит точно, но не без-

ошибочно. Приблизительно один раз на 1 миллион при эксцизии про-

фага рекомбинация осуществляется не в attλ-сайте, а захватывает уча-

стки gal или bio. Полагают, что это обусловлено «неправильным» об-

разованием петли при дезинтеграции профага. В результате этого при-

легающая к профагу область бактериального генома выщепляется из

состава хромосомы и переходит в состав генома свободного фага.

Соответствующая по расположению в петле область генома профага

остается в бактериальной хромосоме (рис. 73). Таким образом, между

профагом и бактериальной хромосомой осуществляется генетический

обмен. Встраивающийся в геном фага бактериальный генетический

материал может заместить до 1/3 генетического материала фага.

Рис. 73. Схематическое образование дефектных фаговых частиц

После упаковки такой фаговой ДНК, в которой ее часть замещена

бактериальной ДНК, в фаговую головку образуются дефектные фаго-

вые частицы. Фаг дефектен, потому что емкость головки ограничена и

при включении в его геном фрагмента бактериальной ДНК, часть фа-

гового генома остается в хромосоме бактерий. Если дефект несущест-

237

венен, то фаг живет, так как его белковая оболочка недефектна (ад-

сорбция возможна). Такой дефектный фаг может заражать другие

клетки, но не может вызвать репродуктивную инфекцию, так как ге-

ны, ответственные за репродукцию, отсутствуют. Если в таком де-

фектном фаге в ДНК сохранились липкие концы, обеспечивающие

превращение ее в циркулярную форму, то ДНК дефектного фага вме-

сте с фрагментом бактериальной ДНК может встроиться в ДНК реци-

пиентных бактерий и вызвать их лизогенизацию.

Было установлено, что при индукции профага λ чаще образуются

дефектные частицы, содержащие в своем геноме гены локуса gal. Та-

кие дефектные частицы обозначают λdgal (от фаг λ, defective, gal). Ес-

ли в геноме фага λ содержится ген, ответственный за синтез биотина,

то – λdbio.

Следовательно, если фаголизатом, полученным после заражения

донорных бактерий фагом λ, в котором содержится дефектные части-

цы, обработать реципиентные клетки bio

или gal

, то с частотой 10

-5

– 10

-6

образуются трансдуктанты bio

или gal

Специфическая трансдукция у E.coli осуществляется не только фа-

гом λ, но и родственными ему фагами, получившими наименование

ламбдоидных фагов. К числу таких фагов относятся Phi 80, 434, 21 и

некоторые другие.

В частности фаг Phi 80 включается в хромосому вблизи генов, ко-

дирующих ферменты, ответственные за синтез триптофана. По этой

причине фаг Phi 80 пригоден для переноса генов trp.

Было установлено, что фаг P22 S.typhimurium кроме общей транс-

дукции может осуществлять и специфическую трансдукцию. При ли-

тическом цикле развития бактериофаг Р22 может осуществлять об-

щую трансдукцию, а при лизогенизации – специфическую. ДНК фага

Р22 интегрируется в участок хромосомы рядом с генами, ответствен-

ными за синтез пролина. Интеграция профага резко стимулирует об-

разование специфически трансдуцирующих частиц.

Таким образом, для осуществления специфической трансдукции

необходима предварительная лизогенизация бактерий-доноров и по-

следующая индукция профага. Образовавшиеся при этом дефектные

трансдуцирующие частицы фагов заражают клетки реципиентного

штамма, происходит их лизогенизация, т.е. встраивание профага с

участком генома бактерий донора в хромосому реципиента.

Использование трансдукции:

238

- можно трансдуцировать плазмиды и короткие фрагменты хромо-

сомы донора;

- для конструирования штаммов заданного генотипа, в частности

изогенных штаммов. Здесь малый размер передаваемых фрагментов

обеспечивает преимущество трансдукции перед конъюгацией. Изо-

генные штаммы, сконструированные при помощи генерализованной

трансдукции, различаются только по участку хромосомы, переноси-

мому трансдуцирующим фагом;

- для точного картирования бактериальных генов, установления по-

рядка и их расположения в оперонах и тонкой структуры отдельных

генетических детерминант. Это делают с помощью комплементаци-

онного теста. Известно, что для синтеза определенной группы про-

дуктов необходимо функционирование нескольких генов. Допустим,

что для синтеза какого-то фермента нужны гены а и b. Пусть есть 2

фенотипически одинаковые мутанты (АВ)

и (АВ)

, но мы не знаем

они генетически идентичны или различны. Для идентификации гено-

типа проводят трансдукцию, т.е. размножают фаг на клетках одной

популяции, а затем фаголизатом заражают вторую популяцию. Если

затем при высеве на селективную среду формируются большие коло-

нии истинных трансдуктантов и маленькие колонии абортивных

трансдуктантов, тогда делают вывод, что мутации находятся в разных

генах:

Если образуются только колонии истинных трансдуктантов, тогда

делают вывод, что мутации находятся в одном гене, но в разных сай-

тах:

Если трансдуктанты вообще не образуются, то данные мутации

идентичны: