Лысак В.В. Микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

109

Проточное культивирование осуществляется в аппаратах двух ти-

пов: хемостатах и турбидостатах. Хемостат состоит из сосуда-

культиватора, в который из другого резервуара с заданной постоянной

скоростью поступает питательная среда. Для равномерного распреде-

ления питательных веществ содержимое культиватора механически

перемешивается. Содержимое культиватора аэрируется стерильным

воздухом для снабжения клеток кислородом. Излишняя микробная

масса с питательной средой через сливной сифон вытекает из культи-

ватора.

Турбидостат – это такой же хемостат, но снабженный фотоэлек-

трическим элементом, регистрирующим мутность среды. Когда плот-

ность биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного

уровня, фотоэлемент, соединенный системой реле, включает подачу

свежей питательной среды.

Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промыш-

ленных и лабораторных условиях применяют биореакторы или фер-

ментеры. Ферментеры представляют собой герметические котлы, в

которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены

автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать

постоянную температуру, оптимальные рН и редокс-потенциал, дози-

рованное поступление необходимых дополнительных питательных

веществ. Кроме того, они постоянно продуваются стерильным возду-

хом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда посто-

янно перемешивается.

Непрерывное культивирование широко используется в промыш-

ленной микробиологии. Кроме того, оно используется при проведении

физиологических, биохимических и генетических исследований, так

как при данном культивировании наблюдается постоянство плотно-

сти популяции и концентрации всех компонентов питательной среды.

Однако, часто для изучения процессов обмена веществ на протяжении

цикла клеточного деления необходимо, чтобы все клетки суспензии

делились одновременно (синхронно). Культуры, в которых все клетки

находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одно-

временно, называют синхронными. Синхронизировать деление в ка-

кой либо популяции клеток можно с помощью различных искусствен-

ных приёмов, таких как изменение температуры, воздействие света

(для фототрофных микроорганизмов), ограничение количеств пита-

тельных веществ или пропускание микроорганизмов через специаль-

ный фильтр, чтобы получить клетки одного размера. Но синхронизи-

110

рованная культура после двух, трёх генераций переходит к асинхрон-

ному делению.

Культивирование иммобилизованных клеток микроорганиз-

мов находит широкое применение в биотехнологии, а именно в про-

изводстве ценных органических веществ, в деградации вредных при-

родных соединений и промышленных отходов с целью очистки сточ-

ных вод от загрязнений.

Методы иммобилизации клеток основаны на способности микро-

организмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют хи-

мические, механические и физические методы иммобилизации мик-

роорганизмов.

Химический способ заключается в образовании ковалентной связи

между какой-то из функциональных групп на поверхности клетки и

носителем. Этот метод применяется редко, так как клетки в этом со-

стоянии могут терять активность.

Механический метод основан на полимеризации какого-либо ма-

номера, смешанного с суспензией бактерий. В результате микроорга-

низм оказывается заключенным в ячейку, которая ограничивает его

перемещение, но не препятствует поступлению питательных веществ.

Чаще всего в качестве носителя используют полиакриламидный гель.

В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток

путем их включения в белковые мембраны с использованием коллаге-

на, казеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с

иммобилизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в

колонку, через которую пропускают субстрат.

Физический метод иммобилизации заключается в адсорбции мик-

роорганизмов на поверхности различных синтетических пористых ма-

териалов.

Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную

активность, что позволяет использовать их в непрерывно действую-

щих технологических процессах. При этом также облегчается выделе-

ние продуктов биосинтеза.

5.3. Культивирование микроорганизмов

в лабораторных условиях

Для культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях

используют питательные среды. Питательная среда должна содержать

все вещества, необходимые для их роста. В связи с тем, что конструк-

тивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разно-

111

образны, универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех

без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для культи-

вирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И

именно эти соединения определяют специфичность подавляющего

большинства сред.

Для культивирования автотрофных микроорганизмов необходимо

обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация углекислоты в

воздухе не превышает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффу-

зии недостаточно для интенсивного роста микроорганизмов. Поэтому

в среды для культивирования автотрофов вносят чаще всего углекис-

лый кальций (СаСО

) или другие карбонаты. Можно вносить также

бикарбонат натрия (NaHCO

). В некоторых случаях через среду про-

дувают воздух, искусственно обогащенный 1–5% углекислоты.

Потребности гетеротрофов не могут быть удовлетворены углеки-

слотой. Для их развития среда должна содержать органические соеди-

нения. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорга-

низмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения

углерода – органические кислоты, спирты, углеводы, углеводороды,

ароматические соединения и др. Но чаще всего в лабораторной прак-

тике используют в качестве источника углерода глюкозу, так как это

наиболее усвояемое микроорганизмами соединение углерода.

Вторым основным компонентом питательной среды является ис-

точник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки

главным образом в восстановленной форме – в виде амино (– NH

или имино (– NH)- групп. Потребности микроорганизмов в источнике

азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими со-

единениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности.

Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В

этом случае вносят в среды NH

Cl или (NH

)

. Следует однако

помнить, что аммонийные соли – физиологически кислые соли, так

как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион

соответствующей кислоты, что приводит к заметному возрастанию

кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие мик-

роорганизмов.

Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут

быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивиро-

вания таких микроорганизмов содержат KNO

или NaNO

. В отличие

от солей аммония нитраты – это физиологически щелочные соли, так

112

как при использовании аниона NO

в среде накапливаются катионы

или Na

. Нитриты для многих микроорганизмов токсичны, поэтому

в качестве источника почти не используются.

Наиболее требовательные к азоту микроорганизмы культивируют

на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполно-

го расщепления – пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли-

и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, со-

лей и микроэлементов. Их получают в результате воздействия протео-

литических ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин)

или растительного (соевая мука) происхождения. Необходимо иметь в

виду, что пептон микроорганизмы могут использовать не только как

источник азота, но и как источник углерода и энергии.

Кроме источников углерода и азота микроорганизмам для по-

строения веществ клетки необходимы: сера, фосфор, калий, магний,

кальций и другие макроэлементы. Все они должны содержаться в пи-

тательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребно-

сти в этих элементах удовлетворяются обычно за счет минеральных

солей. Так, потребности подавляющего большинства микроорганиз-

мов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится

в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп.

Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганиз-

мов в фосфоре. Все необходимые металлы – K, Na, Ca, Mg – и другие

элементы микроорганизмы получают в форме катионов или анионов

неорганических солей. Например, источником магния служит

MgSO

, источником натрия – NaCl, кальция – CaCO

или CaCl

Помимо макроэлементов многие микроорганизмы требуют нали-

чия в среде так называемых факторов роста. Факторы роста могут

быть двух типов: неорганические и органические. К неорганическим

факторам роста относятся микроэлементы – Co, Zn, Mo, Mn, Fe, Cu и

другие. Микроэлементы входят в состав активных групп многих фер-

ментов. В качестве органических факторов служат витамины, пури-

ны, пиримидины и аминокислоты. Факторы роста добавляют в пита-

тельную среду в значительно меньших количествах, чем макроэле-

менты. Следует помнить, что микроорганизмы не усваивают амино-

кислоты в D-форме, а лишь в L-форме.

Потребности микроорганизмов сразу в нескольких аминокислотах

часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для полу-

чения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, жела-

тину, казеин) или растительного (семена сои, подсолнечника, кукуру-

113

зы) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водо-

росли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолитических

ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с креп-

кими щелочами.

Некоторые натуральные вещества содержат сразу различные фак-

торы роста (витамины, минеральные соли, аминокислоты). К ним от-

носятся дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт.

Все питательные среды по составу делятся на натуральные или

синтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из

продуктов животного или растительного происхождения. К таким

средам относятся овощные или фруктовые соки; животные ткани; мо-

локо; отвары мяса, почвы; различные части растений; клетки микро-

организмов. На натуральных средах хорошо развиваются многие мик-

роорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты,

необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют

сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для

изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно

учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов

метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для

поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для

диагностических целей. Синтетические среды – это среды, в которые

входят лишь соединения определенного химического состава, взятые

в точно указанных количествах. Синтетические среды широко

используются при исследовании обмена веществ, физиологии и

биохимии микроорганизмов.

Наряду с натуральными и синтетическими средами выделяют по-

лусинтетические среды. Главными компонентами полусинтетических

сред являются соединения известного химического состава – углево-

ды, соли аммония или нитраты, фосфаты и др. Однако в их состав все-

гда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрож-

жевой экстракт, почвенный экстракт, кукурузный экстракт или гидро-

лизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промыш-

ленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, анти-

биотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорга-

низмов.

По назначению среды подразделяют на элективные и дифференци-

ально-диагностические. Элективные среды предназначены для выде-

ления микроорганизмов из мест их естественного обитания. Они

обеспечивают преимущественное развитие определенной физиологи-

114

ческой группы микроорганизмов. Дифференциально-диагностические

среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганиз-

мов от других и выявить некоторые их особенности. Эти среды осо-

бенно широко применятся в санитарной и медицинской микробиоло-

гии для быстрой идентификации микроорганизмов. Примером таких

сред являются среды Гисса, которые используются для изучения саха-

ролитических свойств микроорганизмов, т.е. способности ферменти-

ровать те или иные углеводы и спирты. В состав среды Гисса входит

основной фон (пептон и K

HPO

), индикатор (бромтимоловый синий,

бромкрезоловый пурпурный, водный голубой + розоловая кислота,

Андреде и др.) и один из изучаемых углеводов или спиртов. Различа-

ют малый и большой пестрый ряд Гисса. В малый ряд Гисса входят

следующие углеводы и спирты: глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза и

маннит. В большой пестрый ряд Гисса входят кроме тех, что образуют

малый ряд Гисса, другие углеводы и спирты, например, арабиноза,

рамноза, сорбит, дульцит и т.д. Среды Гисса можно использовать в

жидком или полужидком состоянии. В последнем случае к жидкой

среде добавляют 0,5 % агар-агара. Рост микроорганизмов на средах

Гисса может приводить к накоплению органических кислот, ней-

тральных продуктов и газов. Выделение этих продуктов регистриру-

ется по изменению рН среды. Например, если среда Гисса содержит

индикатор бромтимоловый синий, то цвет ее будет изменятся в зави-

симости от рН следующим образом: рН = 7,0 – зеленый; рН > 7,0 –

синий; рН < 7,0 – желтый.

По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и плотные

или твердые среды. Жидкие среды применяют для накопления био-

массы или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохи-

мии микроорганизмов. Сыпучие среды применяют главным образом в

промышленной микробиологии для культивирования некоторых про-

дуцентов физиологически активных соединений. К таким средам от-

носятся, например, разваренное пшено, отруби и др. Плотные среды

используют для выделения чистых культур, для определения количе-

ства жизнеспособных микроорганизмов, для хранения культур в кол-

лекциях, для накопления биомассы и др. С целью уплотнения сред

применяют агар-агар, желатину или силикагель (кремнекислый гель).

Чаще всего используют для уплотнения агар-агар. Он представляет

собой сложный полисахарид, в состав которого входят агароза и ага-

ропектин. Агар-агар получают из красных морских водорослей. Агар-

агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют

115

его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который

плавится примерно при 100 ºС и затвердевает при температуре 40 ºС.

Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорга-

низмы при относительно высокой температуре. Желатина – это экс-

тракт, получаемый из субстратов, богатых коллагеном – белком кос-

тей, хрящей, сухожилий, чешуек. Образуемый желатиной гель пла-

вится при температуре 25 ºС, которая ниже обычной температуры ин-

кубации многих микроорганизмов (30 – 37 ºС). Кроме того, желатина

разжижается протеолитическими ферментами, которые многие мик-

роорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатины ограничива-

ют ее применение в качестве уплотняющего средства. Кремнекислый

гель (силикагель) используют как твердую основу для синтетических

сред строго определенного состава.

Для жизнедеятельности микроорганизмов существенное значение

имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как

плотность среды, аэрация, температура, свет и влажность. Развитие

микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого

фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы

часто неодинаковы.

Так как рН среды имеет решающее значение для роста многих

микроорганизмов, то в приготовленных средах всегда следует опреде-

лять значение рН. рН сред может изменяться в процессе стерилиза-

ции, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до

нужного значения, если это требуется, стерильными растворами низ-

кой концентрации кислоты или щелочи. рН среды часто меняется в

процессе культивирования микроорганизмов. Чтобы не допустить

чрезмерного изменения рН в культурах микроорганизмов и удержать

его на необходимом уровне, используют различные приемы. Иногда в

среды добавляют буферные растворы или избыточное количество ме-

ла, который нейтрализует образовавшиеся кислоты. Но лучше всего

контролировать рН среды в ферментерах, приспособленных для про-

точного культивирования. Мы уже установили, что микроорганизмы

по-разному относятся к молекулярному кислороду. Это определяет

различия и в способе их культивирования.

Культивирование аэробных микроорганизмов:

- культивирование на поверхности плотных сред и в тонком слое

жидких сред. В этом случае микроорганизмы получают кислород не-

посредственно из воздуха;

116

- глубинное культивирование в жидких средах. При этом способе

культивирования микроорганизмы используют растворенный кисло-

род. Так как растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, что-

бы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды ее не-

обходимо постоянно аэрировать. Наиболее простой и широко распро-

страненный в лабораторной практике способ глубинного культивиро-

вания – выращивание на шейкерах, обеспечивающих встряхивание

колб или пробирок со скоростью 100 – 200 и более оборотов в минуту.

Помимо перемешивания аэрировать культуру микроорганизмов мож-

но продуванием под давлением через толщу среды стерильного воз-

духа.

Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно,

чем выращивание аэробов, так как здесь должно быть сведено к ми-

нимуму соприкосновение микроорганизмов с молекулярным кислоро-

дом. Для этого используют различные принципы создания анаэроб-

ных условий. Их подразделяют на: физические, химические и биоло-

гические. Они все основаны на том, что микроорганизмы культиви-

руют в каком-то замкнутом пространстве. К физическим принципам

создания анаэробных условий относится выращивание микроорганиз-

мов в микроанаэростатах – вакуумных металлических камерах, снаб-

женных манометром. Анаэростатом может служить обычный стек-

лянный эксикатор с притертой крышкой. Из анаэростата откачивают

воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоя-

щей из азота (80 – 90%) и углекислоты (10 – 20%) до давления поряд-

ка 500 мм.рт.ст.

К химическим принципам создания анаэробных условий относится

использование химических веществ, поглощающих кислород. В каче-

стве поглотителей кислорода в лабораторной практике используют

щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na

), металли-

ческое железо, хлорид одновалентной меди, и некоторые другие реак-

тивы. Поглотители помещают на дно химического эксикатора. В него

помещают анаэробные микроорганизмы, засеянные в пробирку, колбу

или чашку Петри. Эксикатор закрывают притертой крышкой. При

этом способе создания анаэробных условий необходимо учитывать

поглощающую способность реактивов и объем замкнутого простран-

ства, в котором выращивается культура.

Биологический способ создания анаэробных условий заключается

в следующем. Питательную среду в чашке Петри разделяют желобком

на две половины. На одной половине засевают бактерии – строгие аэ-

117

робы, а на второй – строгие анаэробы. Чашку закрывают, щель между

донышком и крышкой заливают парафином или воском. Затем ее по-

мещают в термостат с оптимальной для роста микроорганизмов тем-

пературой. Сначала растут аэробные микроорганизмы (до тех пор по-

ка есть О

), потом начинают размножаться анаэробы.

Наиболее простыми способами ограничения доступа воздуха к

культуре являются:

- выращивание в высоком слое среды;

- выращивание в толще плотной среды;

- культивирование в вязких средах. Диффузия молекулярного ки-

слорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости;

- заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелиново-

го масла или парафина.

118

Глава 6. МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ

Метаболизм – это совокупность биохимических процессов, про-

текающих в клетке и обеспечивающих её жизнедеятельность. Клеточ-

ный метаболизм складывается из двух противоположно направленных

процессов: энергетического метаболизма (катаболизма) и конструк-

тивного метаболизма (анаболизма).

Энергетический метаболизм (катаболизм) – это совокупность

реакций окисления различных восстановленных органических и неор-

ганических соединений, сопровождающихся выделением энергии, ак-

кумулируемой клеткой в форме фосфатных связей.

Конструктивный метаболизм (анаболизм) – это совокупность

реакций биосинтеза, в результате которых за счёт веществ, посту-

пающих извне, и промежуточных продуктов, образующихся при ката-

болизме (амфиболитов), синтезируется вещество клеток. Этот процесс

связан с потреблением свободной энергии, запасенной в молекулах

АТФ или других богатых энергией соединениях.

Конструктивный и энергетический метаболизмы состоят из мно-

жества последовательных ферментативных реакций. Их условно мож-

но разделить на три этапа. На начальном этапе воздействию подвер-

гаются молекулы химических веществ, служащих исходными суб-

стратами. Иногда эту часть метаболического пути называют перифе-

рическим метаболизмом, а ферменты, катализирующие первые эта-

пы превращения субстрата – периферическими. Последующие пре-

вращения включают ряд ферментативных реакций и приводят к обра-

зованию промежуточных продуктов – промежуточный метаболизм.

Образующиеся на последних этапах конечные продукты конструктив-

ных путей используются для построения вещества клеток, а

энергетических выделяются в окружающую среду.

Конструктивные и энергетические процессы протекают в клетке

одновременно. У большинства прокариот они тесно связаны между

собой. В процессе анаболизма синтезируются многочисленные фер-

менты, участвующие в энергетическом метаболизме. С другой сторо-

ны, реакции катаболизма не только дают энергию для биосинтеза, но

и являются источником многих промежуточных продуктов, которые

используются для синтеза веществ, необходимых для построения кле-

точных структур.

Метаболизм прокариот, как энергетический, так и конструктив-

ный, отличается чрезвычайным разнообразием. Это является резуль-

татом того, что бактерии могут использовать в качестве источников