Лабораторный практикум по микробиологии

Подождите немного. Документ загружается.

Таблица № 7. Некоторые санитарно-бактериологические нормативы (СанПиН

2.3.2.560-96)

Продукт

Микробное число

допустимое количе-

ство микроорганиз-

мов (КОЕ в 1 мл или

1 г)

Масса продукта (г), в которой не

допускаются

Другие показатели

БГКП

(коли-

формы)

патогенные, в

том числе

сальмонеллы

aureus

Фарш говяжий 5-10

0,0001 25 -

Колбасы с/к и с/к

изделия из мяса

убойных

животных

- 0,1 25 1,0

Сульфитвос.

клостридии в 0,01 г

не доп.

Колбасные

изделия вареные

(1 сорт)

2,5*10

1,0 25 1,0

Сульфитвос.

клостридии в 0,01 г

не доп.

Молоко паст. (в

пакетах)

5*10

1,0 25 1,0 -

Сыр Российский - 0,001 25

<500

КОЕ/г

Мороженое 1*10

0,01 25 1,0 -

Контрольные вопросы см. занятие № 4.

ЗАНЯТИЕ № 7

ПОЧВЕННЫЕ МИКРОБОЦЕНОЗЫ

Цель: Изучить видовой состав и распределение почвенных микроорганизмов.

Задачи

1.Изучить характер микрофлоры почвы и доминирующие виды.

2. Произвести количественный и качественный учет микрофлоры почвы.

Материалы и оборудование. Предметные стекла, стерильные чашки Петри с МПА,

весы, разновесы, скальпель, ступка, резиновая перчатка, колба со стерильной

дистиллированной водой 90 мл, стерильная колба объемом 250 мл, пробирки с 9 мл

стерильной воды, пипетки на 10 мл и 1 мл, микропипетки на 0,1 мл, стеклянные шпатели.

Основные понятия. Симбиоз, метабиоз, антагонизм, паразитизм.

Ход работы

Задание № 1. Изучить характер почвенных и ризосферных микробоценозов методом

обрастания стекол (по Холодному).

На ровной поверхности почвы делают ножом разрез, глубина которого зависит от

исследуемого горизонта. Отмытые и обезжиренные стекла (одновременно берут несколько

стекол) плотно прижимают к вертикальной стенке разреза и засыпают почвой. Стекла

выдерживают в почве от недели до нескольких месяцев.

После истечения времени экспозиции убирают почву с тыльной стороны стекол,

опытную поверхность стекол высушивают на воздухе и фиксируют трижды, проводя

тыльной стороной над пламенем горелки. После фиксации стекло погружают в воду опытной

поверхностью вниз, не доводя его до дна. После промывки препарат погружают в раствор

карболового эритрозина на срок от 30 мин до 24 ч. Окрашенные препараты исследуют под

микроскопом с иммерсионной системой. При микроскопировании отмечают характер

микрофлоры, плотность обрастания стекол и доминирующие формы.

Задание № 2. Провести определение ОМЧ почвы.

Приготовление почвенной суспензии методом разведения. Соблюдая стерильность,

отвешивают 10 г почвы и переносят ее в стерильную ступку. Навеску почвы в ступке

увлажняют до пастообразного состояния, добавляя 2-3 мл воды из первой колбы, содержащей

90 мл стерильной воды, и растирают 5 мин пальцем в резиновой перчатке. После растирания

почву из ступки переносят с помощью воды во вторую сухую колбу, получают первое

разведение – 1/10. Почвенную суспензию в колбе встряхивают в течение 5 мин, дают

отстояться 30 с и далее стерильной пипеткой переносят 1 мл почвенной суспензии из колбы в

пробирку № 1 с 9 мл стерильной дистиллированной воды, получают второе разведение –

1/100. Подобным образом готовят ряд последующих разведений почвенной суспензии –

1/1000, 1/10000, 1/100000 и более в зависимости от предполагаемой численности

микроорганизмов (рис. № 1, занятие № 6).

Для выделения и количественного учета бактерий почвенную суспензию высевают на

одну из питательных сред (МПА, КАА, почвенный агар, среду Эшби; для учета

актиномицетов используют КАА или среду Чапека). Колонии бактерий на чашках Петри

подсчитывают через 3 – 5 суток, грибов и дрожжей – через 5 – 7, актиномицетов – через 7 –

15. Содержание микроорганизмов в 1 г почвы определить по формуле: а=б*в, где а –

количество микроорганизмов в 1 г почвы, б – среднее число колоний, в – разведение.

Сравнивают видовой состав и разнообразие микрофлоры почвы, воды и воздуха и делают

вывод.

Контрольные вопросы и задания см. занятие № 4.

ЗАНЯТИЕ № 8

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА

Цель: Изучить особенности процессов превращения микроорганизмами органических

соединений азота.

Задачи

Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах аммонификации белка.

Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах аммонификации мочевины.

Материалы и оборудование: Среда для воспроизведения процесса аммонификации

белка и мочевины, микроскопы, оборудование для приготовления микропрепаратов.

Основные понятия. Аммонификация, протеазы, пептидазы, уреаза, дезаминирование,

декарбоксилирование.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, осуществляющие аммонификацию белка,

сделать рисунок. Для изучения аммонификации белковых веществ питательной средой может

служить мясной бульон с добавлением 3% пептона. По 30 мл среды разливают в колбу на 100

мл и добавляют по 1/3 чайной ложки почвы. Колбы закрывают ватными пробками. Над

средой подвешивают две бумажки – красную лакмусовую, или универсальную индикаторную

бумагу, смоченную дистиллированной водой, для обнаружения выделяющегося аммиака и

фильтровальную, смоченную щелочным раствором ацетата свинца, для выявления

сероводорода и меркаптана. Закрепляют их между пробкой и стенками горлышка колбы.

Бумажки не должны касаться среды. На 3–5 сутки инкубации при 28–30°С содержимое

колбы анализируют. Определяют возбудителей процесса аммонификации белка и продукты

их жизнедеятельности.

Микроскопирование. Для обнаружения возбудителей гнилостного распада белковых

веществ готовят препарат живых бактерий в раздавленной капле, а также фиксированный и

окрашенный препарат. Чаще других, на препарате встречаются подвижные клетки Proteus

vulgaris (рис. № 4 приложения) преобладающие на первых стадиях распада белков. Это

неспорообразующие, неодинаковой длины палочки. Кроме того, на препарате много

спорообразующих клеток Bacillus mycoides и Clostridium sp. (рис. № 1, 4 приложения). У

последних споры расположены терминально и диаметр их превышает ширину клетки. Вас.

mycoides вызывает аммонификацию белковых веществ в аэробных условиях, а С. putrificus –

в анаэробных, но может также развиваться и в аэробных условиях, если в среде находятся

аэробные микроорганизмы, поглощающие кислород.

Выделяющийся в атмосферу NH

окрашивает подвешенную полоску красной

лакмусовой бумаги в синий цвет. Свинцовая бумага чернеет под действием сероводорода

если она покрывается серебристым налетом, значит, наряду с H

S выделяются еще и

меркаптаны (например, метилмеркаптан CH

SH).

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах аммонификации

мочевины, сделать рисунок. Для наблюдения за процессом аммонификации мочевины можно

использовать питательную среду следующего состава (г/л дистиллированной воды): тартрат

калия или натрия (виннокислые, можно соли яблочной кислоты) – 5,0; мочевина – 5,0;

НРО

– 0,5; MgSO

·7H

O – 0,2.

Среду разливают по 30 мл в колбы на 100 мл, заражают почвой и ставят в термостат

при 25–30°С. Для обнаружения аммиака под ватную пробку подвешивают полоску красной

лакмусовой бумаги. Через 3-5 суток культуру подвергают анализу. Устанавливают выделение

аммиака по посинению красной лакмусовой бумажки.

Микроскопирование. Для изучения возбудителей аммонификации мочевины из едва

заметной пленки на поверхности среды готовят препарат и окрашивают его фуксином. Чаще

всего под микроскопом наблюдают клетки Urobacillus pasteurii (Вас. probatus), реже –

Planosarcina ureae (рис. № 5 приложения).

Контрольные вопросы и задания

1. Минерализация азота. Бактерии, участвующие в аммонификации белка.

2. Разложение нуклеиновых кислот.

3. Разложение мочевины, мочевой и гиппуровой кислот.

4. Характеристика процессов нитрификации. Микроорганизмы, осуществляющие

образование нитратов в почве.

5. Восстановление нитратов и нитритов в природе.

6. Денитрификация (диссимиляционная нитратредукция).

7. Ассимиляционная нитратредукция.

8. Азотфиксация свободноживущими микроорганизмами.

9. Ассоциативная азотфиксация.

10. Симбиотическая азотфиксация. Характеристика клубеньковых бактерий.

11. Взаимодействие клубеньковых бактерий с растением-хозяином. Образование

бактероидов.

12. Симбиотическая азотфиксация небобовых растений.

13. Химизм процессов азотфиксации.

14. Заполнить таблицу № 8.

Таблица № 8. Характеристика процессов круговорота азота и микроорганизмов,

участвующих в превращении соединений азота

Процесс

Микроо

рганизм

Исходн

ые

веществ

Продукт

Схема

Фермент

Условия

Аммонификация белка

(аэробные условия)

Аммонификация белка

(анаэробные условия)

Аммонификация

мочевины

I фаза нитрификации

II фаза нитрификации

Денитрификация

Ассимиляционная

нитратредукция

Азотфиксация в почве

(анаэробные условия)

Азотфиксация в почве

(аэробные условия)

Симбиотическая

азотфиксация

ЗАНЯТИЕ № 9

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРОРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА

Цель: Изучить особенности процессов превращения микроорганизмами минеральных

соединений азота.

Задачи

1. Изучить особенности протекания процессов нитрификации (I, II фаза) и

участвующих в них микроорганизмов.

2. Изучить особенности протекания процессов денитрификации и участвующих в них

микроорганизмов.

3. Изучить особенности протекания процессов азотфиксации и участвующих в них

микроорганизмов.

Материалы и оборудование. Колбы с жидкой средой Эшби для культивирования

азотфиксаторов, средой Виноградского для культивирования нитрификаторов, средой

Гильтая для культивирования денитрификаторов, оборудование для окраски

микропрепаратов, микроскопы.

Основные понятия. Нитрификация (I и II фазы), иммобилизация азота,

ассимиляционная нитратредукция, диссимиляционная нитратредукция (денитрификация),

азотфиксация свободноживущими микроорганизмами, ассоциативная азотфиксация,

симбиотическая азотфиксация, леггемоглобин, нитрогеназа, нитратредуктаза.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах нитрификации,

сделать рисунок. Для накопления нитрифицирующих бактерий пользуются питательной

средой С. Н. Виноградского (г/л дистиллированной воды):

Для первой фазы нитрификации:

(NH

)

- 2,0

HPО

- 1,0

MgSO

- 0,5

NaCl - 2,0

FeSO

- 0,4

CaCO

- 5,0

Для второй фазы нитрификации:

NaNО

- 1,0

NaCl - 0,5

HPO

- 0,5

MgSO

- 0,5

FeSO

- 0,4

Среды стерилизуют и разливают в колбы слоем 1,0-1,5 см и заражают комочком

парниковой почвы. Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при

температуре 25-28 °С на 14–21-й день.

Микроскопирование. Для изучения нитрифицирующих бактерий из жидкости в

колбах готовят микропрепараты. В поле зрения микроскопа видны скопления овальных или

кокковидных клеток Nitrosomonas (первая фаза) и коротких палочковидных клеток

Nitrobacter (вторая фаза). Представители рода Nitrosomonas (рис. № 6 приложения) имеют

овальную форму, в отдельных случаях приближающуюся к шарику, обладают подвижностью

и снабжены одним длинным жгутиком. Разные виды Nitrosomonas очень широко распро-

странены в почве и отличаются друг от друга величиной или формой клеток, а также

отношением к активной реакции среды. Наиболее изучен Nitrosomonas europea. Клетки

кокковидные, или овальные, размером 0,5-1,5 мкм, подвижные, с длинным полярно

расположенным жгутиком. Nitrobacter – мелкие округлые, яйцевидные или грушевидные

палочки неподвижные, одиночные или соединенные в небольшие группы, окруженные

слизистой капсулой (рис. № 7 приложения). Среди бактерий этого рода принято различать

два вида: Nitrobacter winogradskii и Nitrobacter agilis.

Окисление аммонийной формы в нитритную также осуществляют Nitrosocystis и

Nitrosospira, нитритной в нитратную Nitrospina.

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, осуществляющие процессы денитрификации,

сделать рисунок. Для накопления денитрифицирующих бактерий используют следующую

среду (в г/л): сегнетова соль – 20; KNO

– 2,0; К

НРО

– 0,5; MgSO

· 7Н

О – 0,2; FeSO

· 7Н

– следы. Среду разливают высоким слоем в большие пробирки до края и стерилизуют.

Тщательно перемешивают с почвой для удаления пузырьков воздуха и закрывают каучуковой

трубкой, в которую вставлена открытая с 2-х сторон стеклянная трубка, расширенная в

средней части. Пробка вытесняет часть жидкости в стеклянную трубку. Под пробкой не

должны оставаться пузырьки воздуха. В трубку над средой наливают вазелиновое масло

небольшим слоем для создания анаэробных условий помещают в термостат при температуре

30 – 35 °С на 5-6 дней.

Микроскопирование. Из середины субстрата чистой пипеткой берут каплю и готовят

фиксированный и окрашенный препарат, который затем рассматривают под микроскопом с

иммерсионной системой. На препарате преобладают неспорообразующие сферические

клетки или короткие палочки Paracoccus denitrificans (Bacterium denitrificans) (рис. № 7

приложения). На среде с сегнетовой солью чаще развивается P. stutzeri (Achromobacter

stutzeri – палочковидные клетки размером 2,0 – 4,0 мкм, подвижные) (рис. № 7 приложения).

В этом случае культура образует зеленовато-желтый флюоресцирующий пигмент. Также к

денитрификаторам относятся: Pseudomonas aeruginosa – мелкие палочки (размером 1,0 – 1,5

мкм), одиночные или соединенные в пары, подвижные, несут 1 – 2 полярных жгутика.

Нередко наблюдается позеленение среды, особенно при использовании углерода лимонной

кислоты, что указывает на развитие Pseudomonas fluorescens – мелкие палочки (размером 1,0

– 2,0 мкм), подвижные, имеют 3 – 4 полярных жгутика.

Задание № 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в фиксации атмосферного

азота, сделать рисунок. Для накопления свободноживущих азотфиксаторов используют среду

Эшби. Состав питательной среды (г/л дистиллированной воды): маннит, глюкоза, или

сахароза – 20,0; К

НРО

– 0,2; MgSO

– 0,2; NaCl – 0,2; K

SО

– 0,1; СаСОз – 5,0.

Питательную среду, не стерилизуя, разливают в колбы объемом 100 – 150 мл, слоем 1

– 1,5 см и заражают парниковой почвой (1/3 чайной ложки). Колбы закрывают ватными

пробками и помещают в термостат при температуре 28 – 30 °С.

Через 5 – 7 суток на поверхности среды образуется коричнево-бурая пленка

азотобактера. Жидкость в колбе пенится и издает запах масляной кислоты, что указывает на

развитие в среде бактерий Cl. pasteurianum.

Микроскопирование. Готовят фиксированный микропрепарат из поверхностной

пленки. Наиболее распространены два вида азотобактера: Azotobacter chroococcum – в

молодой культуре имеет палочковидные клетки, подвижные, размером 3 – 7 мкм (рис. № 8

приложения). В старой культуре клетки кокковидные, соединены в пары и сарциноподобные

пакеты, обычно окружены слизистой капсулой. В клетках много блестящих зерен волютина.

Колонии на плотных питательных средах слизистые, растекающиеся или выпуклые,

бесцветные или окрашенные в темно-коричневый до черного цвет; Azotobacter vinelandii – в

молодой культуре клетки палочковидные, размером 2-3 мкм. В старой культуре форма клеток

шаровидная. Из капли жидкости готовят препарат Clostridium pasteurianum – подвижные

палочковидные клетки, размером 3 – 7 мкм, одиночные или расположенные парами и

короткими цепочками (рис. № 1,10 приложения). Споры овальные, формируются

эксцентрально, при этом клетки-спороносцы принимают форму лимона. В клетках

накапливается много гранулезы. Колонии беловатые, гладкие, блестящие.

Контрольные вопросы см. занятие № 8.

ЗАНЯТИЕ № 10

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА

Цель: Изучить особенности различных видов брожения и морфологию их

возбудителей.

Задачи:

1. Изучить механизм протекания спиртового брожения и морфологию его

возбудителей.

2. Изучить механизм протекания и виды молочнокислого брожения, морфологию его

возбудителей.

3. Изучить особенности преобразования спирта в уксусную кислоту и морфологию

уксуснокислых бактерий.

4. Изучить механизм протекания маслянокислого брожения и морфологию его

возбудителей.

Материалы и оборудование. Рассол, кефир, пекарские дрожжи, пиво, среда для

культивирования маслянокислых бактерий, оборудование для окрашивания препаратов,

микроскопы.

Основные понятия. Спиртовое брожение, эффект Пастера, гомоферментативное

молочнокислое брожение, гетероферментативное молочнокислое брожение.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в спиртовом брожении, сделать

рисунок. В колбу на 250 мл наливают 50 мл 20%-ного раствора сахарозы и около 1 г

дрожжей, разведенных в 10 мл раствора сахарозы (20%). Закрывают и поддерживают

температуру около 35-40°С в течение нескольких дней.

Микроскопирование. Большинство видов культурных дрожжей, используемых на

практике, принадлежат к роду Saccharomyces (Saccharomices cerevisiae, рис. № 1, 2

приложения) и Schizosaccharomyces. Эти дрожжи отличаются от диких тем, что способны

выдерживать большие концентрации сахара (до 70%) и спирта (до 14%), развиваются при рН

4-6, образуют меньше побочных продуктов брожения.

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, участвующие в молочнокислом брожении,

сделать рисунок. Для ознакомления с бактериями молочнокислого брожения

(гомоферментативное брожение) можно воспользоваться готовыми молочнокислыми

продуктами (простокваша, ацидофилин, кефир) и рассолом (гетероферментативное

брожение). Указанные продукты наносят петлей на предметное стекло и делают тонкий

мазок. Окрашивают в течение 3-5 мин водным раствором метиленового синего.

Микроскопирование. В молочнокислых продуктах наиболее часто встречаются

следующие возбудители гомоферментативного брожения – Streptococcus lactis (рис. № 9

приложения), имеющие вид овальных кокков диаметром 0,5-1,0 мкм, располагаются в

культуре попарно (диплококки) или короткими цепочками (стрептококки), реже

одиночными клетками; Lactobacillus bulgaricus (рис. № 9 приложения) – крупная палочка

(длиной 4-5 мкм), неподвижная, грамположительная, располагается в виде отдельных кле-

ток и коротких цепочек, оптимальная температура развития 40-45°С; Lactobacillus

acidophilus – по морфологии близка к болгарской, но имеет другой температурный оптимум

развития – 37°С.

Среди возбудителей гетероферментативного брожения обычны Lactobacillus brevis,

Lactobacillus brassicae, Leuconostoc mesenteroides и др. (микрофлора рассола). Белая или

кремовая бархатистая морщинистая пленка на поверхности рассола или на кефире говорит о

присутствии Geotrichum candidum (Oidium lactis) (рис. № 9 приложения) – молочная

плесень, которая всегда сопутствует молочнокислому брожению.

Задание № 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в превращении спирта в

уксусную кислоту, сделать рисунок. В конические колбы наливают тонкий слой пива (0,5-1,0

см). Колбы закрывают ватными пробками и ставят в термостат при температуре 30°С. Через

5-7 суток описывают характер образовавшихся пленок, микроскопируют окрашенные мазки.

Микроскопирование. Уксуснокислые бактерии объединены в род Acetobacter, ти-

повой вид Acetobacter aceti (рис. № 9 приложения) представлен слабо подвижными па-

лочковидными эллиптическими клетками шириной 0,6-0,8 длиной 1,0-3,0 мкм, одиночными,

в парах или цепочках. Нередко образует инволюционные формы в виде раздутых,

разветвленных или нитевидных образований. Уксуснокислые бактерии легко выделяются из

пива.

Задание № 4. Изучить микроорганизмы, участвующие в маслянокислом брожении.

Неочищенный картофель нарезают ломтиками, заполняют ими пробирку на 1/3 объема,

добавляют щепотку мела и заполняют водой до края. Пробирки ставят на водяную баню при

температуре 80°С на 10-15 мин. Затем пробирки закрывают пробками и переносят в

термостат с температурой 25

С. Через 2-3 дня в жидкости обнаруживают бактерии

маслянокислого брожения.

Микроскопирование. На фиксированных препаратах обнаруживаются Cl.

рasteurianum, Cl. butiricum (рис. № 1, 10 приложения) – подвижные палочки с закругленными

концами, одиночные и парные. В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживают

спору.

Контрольные вопросы

1. Спиртовое брожение.

2. Дрожжи. Форма, строение, размножение и классификация.

3. Окисление этилового спирта в уксусную кислоту.

4. Химизм и возбудители молочнокислого брожения (гомоферментативный тип).

5. Химизм и возбудители молочнокислого брожения (гетероферментативный тип).

6. Маслянокислое и ацетобутиловое брожение.

7. Маслянокислое брожение пектиновых веществ.

8. Анаэробное разложение клетчатки.

9. Окисление микроорганизмами клетчатки.

10. Заполнить таблицу № 9 «Характеристика процессов брожения».

Таблица № 9. Характеристика процессов превращения углерода (процессы брожения

и окисления соединений, не содержащих азот)

Виды брожения/окисления Условия Возбудит

ели

Субстрат

Продукт

Схема

Спиртовое брожение

Молочнокислое

(гомоферментативное)

брожение

Молочнокислое

(гетероферментативное)

брожение

Окисление спирта в уксусную

кислоту

Маслянокислое брожение

Брожение пектиновых веществ

Брожение целлюлозы

Окисление клетчатки

Вопросы для самостоятельного изучения

1. Способы питания и поступления в клетку питательных веществ.

2. Пищевые потребности микроорганизмов.

3. Типы питания микроорганизмов.

4. Метаболизм микроорганизмов. Брожение, дыхание, фотосинтез.

ЗАНЯТИЕ № 11

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА

Цель: Изучить особенности различных видов брожения и морфологию их

возбудителей.

Задачи:

1. Изучить механизм брожения пектиновых веществ и морфологию его возбудителей.

2. Изучить особенности превращения целлюлозы в аэробных условиях и морфологию

его возбудителей.

3. Изучить особенности брожения целлюлозы в анаэробных условиях и морфологию

его возбудителей.

Материалы и оборудование. Накопительные культуры микроорганизмов,

осуществляющих брожение пектиновых веществ, разложение клетчатки, микроскопы,

оборудование для окрашивания препаратов.

Основные понятия. Маслянокислое брожение, пектин, пектиназа, целлюлоза,

целлюлаза.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в брожении пектиновых

веществ, сделать рисунок. Для выделения пектиноразрушающих бактерий используют

льняную или крапивную питательную среду. Из стеблей готовят снопики длиной 5-7 см,

помещают в пробирки, заливают водопроводной водой и кипятят 10-15 мин. Кипячением

удаляют экстрактивные вещества, которые могут служить источником углерода для

сопутствующих маслянокислых бактерий. Воду сливают, снопики заливают новой порцией

воды, пробирки плотно закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при 1 атм

20 мин. Когда пробирки остынут, среду заражают кусочком свежей соломы льна. Зараженные

пробирки помещают в термостат при температуре 35°С. Через 3-5 суток начинается процесс

пектинового брожения, жидкость мутнеет и пенится.

Микроскопирование. Для изучения морфологии бактерий пектинового брожения

готовят прижизненные препараты. Снопик вынимают из пробирки, отжимают каплю

жидкости на предметное стекло, готовят фиксированные и прижизненные препараты (в

растворе Люголя). На препарате видны клетки Clostridium pectinovorum и Clostridium fel-

sineum, вегетативные и спорулирующие, окрашенные иодом на гранулезу в темно-синий цвет

(рис. № 9 приложения).

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, участвующие в разложении клетчатки

(анаэробные условия), сделать рисунок. Для получения накопительной культуры анаэробных

форм целлюлозоразрушающих бактерий используют среду Имшенецкого. В круглую

плоскодонную колбу вносят около 1-2 г фильтровальной бумаги или вату, и заливают до-

верху средой следующего состава (в г/л): KNH

HPO

– 1,0; КН

РО

– 0,5; К

НРО

– 0,5; СаС1

– 0,03; пептон – 5; MgSO

– 0,4; СаСО

– 2,0; NaCl – 0,5; MnSО

и FeSO

следы; рН среды 7,0-

7,4. Среду заражают небольшим количеством почвы, закрывают колбу корковой пробкой с

отверстием для выхода газов и ставят в термостат при 30-35°С. Элективные условия в данном

случае определяются присутствием целлюлозы – источника углерода, который может

потребляться только специфичными целлюлозоразлагающими бактериями, имеющими

фермент целлюлазу, а также анаэробными условиями. Пептон, введенный в среду в

небольшом количестве, сильно стимулирует процесс брожения. Через 7-10 сут начинается

брожение целлюлозы, которое длится 2-3 недели. Фильтровальная бумага по мере сбражива-

ния слегка ослизняется, желтеет и постепенно разрушается.

Микроскопирование. Микроскопируют кусочек бумаги. В анаэробных условиях

процесс разложения клетчатки осуществляется бактериями рода Clostridium. Cl. omelianskii

(рис. № 9 приложения) имеет вид длинных палочковидных клеток до 8 мкм, в старых

культурах длина около 10-15 мкм, расположены одиночно или соединены в нити. Споры

шаровидные, формируются на конце клетки, клетка принимает форму барабанной палочки.

Выделяется из почвы и воды. Оптимальная температура роста 30-35°С.

Задание № 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в разложении клетчатки

(аэробные условия), сделать рисунок. Для выделения аэробных клетчаткоразрушающих

бактерий используют питательную среду Гетчинсона. Состав среды (г/л): К

НРО

– 1,0; NaCl

– 0,1; СаСl

– 0,1; FeCl

– 0,01; MgSO

– 0,3; NaNO

– 2,5; рН среды 7,2-7,3. Стерильную

питательную среду разливают в конические колбы слоем 1,5-2,0 см, среду заражают

комочком почвы и на поверхность среды опускают складчатый фильтр конусом вверх. Колбы

закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25-30°С на 10-14

суток. На границе питательной среды и воздуха создаются оптимальные условия питания и

аэробного дыхания клетчаткоразрушающих бактерий. В этой зоне наиболее интенсивно идет

процесс разрушения фильтровальной бумаги. Через 8-10 суток на фильтре появляются желто-

оранжевые пятна колоний клетчаткоразрушающих бактерий. Бумага разлагается, и фильтр

постепенно оседает на дно.

Микроскопирование. Из разрушенных масс клетчатки в колбе микробиологической

петлей готовят мазок в капле жидкости. Чаще всего на препарате обнаруживаются

представители порядков Мухоbacteriales и Cytophagales группы скользящих бактерий (рис. №

10 приложения). Род Cytophaga представлен длинными палочковидными клетками с

заостренными концами, несколько изогнутыми (2-10 мкм). Колонии желтого, оранжевого,

коричнево-бурого цвета, гладкие, слизистые.

Род Сellvibrlo представлен мелкими, слегка изогнутыми подвижными палочками (2-4

мкм). Колонии охряножелтые слизистые. Рол Cellfalcicula имеет вид коротких толстых

изогнутых палочек с заостренными концами (2,0*0,7 мкм).

Род Sorangium в молодой культуре имеет вид толстых слегка изогнутых

палочковидных клеток с закругленными концами (2-5 мкм). При старении культуры

образуются плодовые тела, состоящие из микроцист. Палочковидные клетки укорачиваются,

покрываются толстой оболочкой, приобретая неправильные очертания. Колонии ярко-

оранжевого, фиолетового цвета.

Род Polyangium представлен почти прямыми палочковидными клетками с

закругленными концами (3,5-8 мкм). При старении формируются овальные микроцисты,

которые соединяются и плодовые тела грушевидной формы. Плодовые тела желтого,

оранжевого цвета, сидят непосредственно на субстрате.

Помимо бактерий, в аэробном разрушении клетчатки участвуют плесневые грибы

Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Trichoderma и некоторые актиномицеты.

Контрольные вопросы см. занятие № 10.

ЗАНЯТИЕ № 12

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель: Изучить влияние экологических факторов на рост и развитие микроорганизмов.

Основные понятия. Облигатные психрофилы, психротрофные микроорганизмы

(факультативные психрофилы), термофилы, осмотолерантные микроорганизмы, галлофилы,

лиофилизация, облигатные аэробы и анаэробы, микроаэрофилы, аэротолерантные анаэробы,

антисептики.

Контрольные вопросы

1. Влияние температуры на рост и развитие микроорганизмов. Экологические группы

бактерий по отношению к температуре.

2. Влияние влажности на рост и развитие микроорганизмов.

3. Влияние света и различных излучений на рост и развитие микроорганизмов.

Влияние магнитного поля.

4. Влияние концентрации кислорода на рост и развитие микроорганизмов.

5. Влияние реакции среды на рост и развитие микроорганизмов. Соединения и ионы,

токсичные для бактерий.

6. Адаптивные реакции микроорганизмов.

ЗАНЯТИЕ № 13

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

Цель: Провести определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Задачи:

1. Произвести определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

методом диффузии в агар с применением бумажных дисков

Материалы и оборудование. Чашки Петри с МПА, стерильные диски, смоченные

растворами антибиотиков, чистые культуры сапрофитных бактерий и плесневых грибов,

пипетки, спиртовки, шпатели.

Основные понятия. Антибиотики, бактериостатический и бактерицидный эффекты,

R-факторы, резистентность.

Ход работы

Задание № 1. Произвести определение чувствительности микроорганизмов к

антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков.

Диско-диффузионный метод определения чувствительности микроорганизмов к

антибиотикам основан на регистрации диаметра зоны подавления роста вокруг бумажного

диска с антибиотиком. На поверхность питательного агара в чашках Петри, засеянного

испытуемыми микробами, наносят бумажные диски, пропитанные антибиотиками, и

чашки инкубируют при 37°С. Наличие зоны задержки роста микробов вокруг дисков

свидетельствует о чувствительности возбудителя к препарату, отсутствие зоны задержки

роста – об устойчивости.

Ход определения. В стерильные чашки Петри с МПА наносится культура

микроорганизмов. В качестве посевного материала используется суточная бульонная

культура – 0,2 мл бактериальной взвеси наносится на поверхность МПА и равномерно

распределяется путем покачивания чашки с последующим отсасыванием избытка жидкости

пипеткой.

Чашки подсушивают в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Затем на

поверхность засеянной среды пинцетом накладывают диски, пропитанные различными

антибиотиками. Диски накладывают на поверхность плотно для тесного контакта со

средой. Диски размещают на равном расстоянии один от другого и примерно на 2 см от

края чашки. Чашки ставят в термостат перевернутыми кверху дном или вкладывают под

крышку чашки кружок фильтровальной бумаги, чтобы избежать размывания газона

конденсационной водой, и инкубируют при 37°С в течение 18-ти часов.

Оценка результатов. С помощью линейки определяют диаметр зон задержки роста

микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Единичные колонии или тонкая

пленка роста микроорганизмов внутри зоны задержки роста не учитывается. Отсутствие

зон задержки роста микробов вокруг дисков указывает на отсутствие чувствительности

микроба к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мм

штамм расценивается как мало чувствительный. Зона задержки роста микроба более 10 мм

указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста, тем выше

чувствительность микроорганизмов к антибиотику. Результаты занести в таблицу №10.

Таблица № 10. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам.

Антибиотик

Размер зоны задержки роста (мм) для разных микроорганизмов

Виды микроорганизмов

E.coli

…

ампициллин

цефотоксим

…

Контрольные вопросы

1. Антибиотики, их практическое значение. Антагонизм микроорганизмов.

2. Открытие антибиотиков.

3. Классификация антибиотиков.

4. Единицы биологической активности антибиотиков.

5. Биологическая роль в природе.

6. Антибиотические свойства стрептомицина.

7. Антибиотические свойства пенициллина.

ЗАНЯТИЕ № 14

ОСНОВЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Цель: Изучить микроорганизмы – патогены животных и человека.

Литература

1. Лебедева М.Н. Микробиология. – М.: «Медицина», 1969.

2. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии / Под. Редакцией Воробьева

А.А., Кривошеина Ю.С. – М.:Мастерство, 2001.

Вопросы для обсуждения

1. Характеристика патогенных кокков на примере стафилококков. Воспалительно-

гнойные заболевания кожи. Септицемия.

2. Характеристика патогенных кокков на примере стрептококков. Локализованные

гнойно-воспалительные инфекции, тонзиллит, скарлатина.

3. Характеристика патогенных кокков на примере пневмококка. Пневмонии.

4. Характеристика патогенных кокков на примере менингококка. Менингит.