Курсовая работа - Определение витамина В12 в биологических объектах
Подождите немного. Документ загружается.
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ
НТУ «ХПИ»
Кафедра аналитической химии и биотехнологии
ПО ТЕМЕ:
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В12 В
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЬЕКТАХ
СТУДЕНТКИ 3-го КУРСА
ГРУППЫ О-57а
КУПИНОЙ А. В.
ПРЕПОДАВАТЕЛЬ
БЕЛЫХ И. А.
ХАРЬКОВ-2009
СОДЕРЖАНИЕ
1. Вступление
2. Витамин В12 (циклокобаламин)
Общая характеристика
- химическая формула и структура
- действие цианокобаламина в организме
- источники витамина и суточная потребность
3. Общая информация об определении витаминов в биообъектах
Биологические и физико-химические методы
4. Определение витамина В12 различными методами
Хроматография
Иммуноферментный метод
Определение в растворах
- спектрофотометрия
- колориметрический метод
Определение в кристаллическом препарате
Определение цианокобаламина c Escherichia coli
Выделение В12 из микробной массы и животных тканей
5. Заключение
6. Список использованной литературы
ВСТУПЛЕНИЕ
Витамины – это вещества, которые относятся к
незаменимым факторам питания человека и животных. Это
низкомолекулярные биологические активные вещества,
обеспечивающие нормальное течение биохимических и
физиологических процессов в организме. Они является необходимой
составной пищи и оказывают действие на обмен веществ в очень
малых количествах. Суточная потребность в витаминах измеряется в
миллиграммах, микро граммах. Некоторые витамины могут вообще не
синтезироваться в организме или синтезироваться в недостаточных
количествах и должны поступать извне (суточная потребность холина
- 1 г/сут, суточная потребность в полиненасыщенных высших жирных
кислотах 1 г/сут).
Все витамины разнообразные по химическому строению, и
свойствам. И их разделяют на 2 группы по растворимости:
водорастворимые витамины - С, группа В, и др.
жирорастворимые - А,Д,Е,К.
Витамины называют или латинскими буквами (А,В,С,D). Некоторые
буквы, например В, охватывают целые группы: от B1 до B15. Ещё эти
вещества называют химическим названием или по авитаминозу
который присущ данному витамину.
Витамин В12 (Цианокобаламин)
Химическая формула
Соa-[a-(5,6-Диметилбензимидазолил)]-Соb-кобамидцианид или
a-(5,6-диметилбензимидазолил)-кобамидцианид
Химическая структура
B
12
имеет самую сложную по сравнению с другими витаминами
структуру, основой которой является корриновое кольцо. Коррин во
многом аналогичен порфирину (сложной структуре, входящей в состав
гема, хлорофилла и цитохромов), но отличается от порфирина тем,
что два пиррольных цикла в составе коррина соединены между собой
непосредственно, а не метиленовым мостиком.
В центре корриновой структуры располагается ион кобальта. Четыре
координационных связи кобальт образует с атомами азота. Ещё одна
координационная связь соединяет кобальт с
диметилбензимидазольным нуклеотидом. Последняя, шестая
координационная связь кобальта остаётся свободной: именно по этой
связи и присоединяется цианогруппа, гидроксильная группа,
метильный или 5'-дезоксиаденозильный остаток с образованием
четырёх вариантов витамина B
12
, соответственно. Ковалентная связь
углерод-кобальт в структуре цианокобаламина — единственный в
природе пример ковалентной связи металл-углерод.
Краткая характеристика витамина
Цианокобаламин – является одним из немногих водорастворимых
витаминов, которые накапливаются в человеческом организме.
Витамин B12 аккумулируется в таких органах как почки, печень и
легкие, а так же селезенка. Оказывает существенное влияние на
процессы обмена веществ - белков, синтез аминокислот, нуклииновых
кислот, пуринов. Стимулирует рост у детей.
Витамин B12 представлен в виде насыщенно красного порошка, без
вкуса и запаха. Витамин В12 не теряет своих свойств при воздействии
высоких температур и попадании прямых солнечных лучей.
Витамину В12, точнее кобамидным коферментам, принадлежит
важнейшая роль в синтезе, а возможно, и в переносе подвижных
метильных групп. В процессах синтеза и переноса одноуглеродистых
фрагментов наблюдается связь (механизм которой ещё не выяснен)
между фолиевыми кислотами и группой кобаламина. Предполагают,
что витамин В12 учавствует также в ферментной системе.
Невозможность использования в организме В 12 возникает в
результате атрофии железистых клеток дна желудка, продуцирующих
гастромукопротеин, который является обязательным компанентом,
обеспечивающим усвоение этого витамина организмом.
Действие цианокобаламина в организме
Цианокобаламин обладает выраженным липотропным действием, он
предупреждает жировую инфильтрацию печени, повышает
потребление кислорода клетками при острой и хронической гипоксии.
Витамин B
12
участвует в процессах трансметилирования, переноса
водорода. Цианокобаламин принимает непосредственное участие в
процессе синтеза метионина. Также витамин B
12
играет важную роль в
регуляции функции кроветворных органов: он принимает участие в
синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеиновых кислот,
необходимых для процесса эритропоэза, активно влияет на
накопление в эритроцитах соединений, содержащих сульфгидрильные
группы.
Цианокобаламин помогает нормализовать пониженное кровяное
давления. Стимулируя синтез протеина в человеческом организме,
витамин В12 является своеобразным анаболиком. В самое последнее
время получены данные, что витамин B12 имеет важное значение и
для образования костей. Рост костей может происходить лишь в том
случае, когда в остеобластах (клетках, из которых создаются кости)
имеется достаточный запас витамина. Витамин В12 увеличивает
количество лейкоцитов и ускоряет их деятельность, то есть
воздействует на ретикулоэндотелиальную систему, благодаря
данному препарату повышается сопротивляемость организма всем
возможным заболеваниям. Недостаток витамина B12 значительно
сокращает жизнь больных СПИДом. Витамин В12 стимулирует
деятельность кровеносных органов и оказывает существенное
влияние на способность человека к восприятию и усвоению новой
информации. Его недостаток вызывает депрессивное состояние и
рассредоточение внимания. Витамин B
12
является одним из веществ,
необходимых для здоровья репродуктивных органов - Очень важен
для поддержания в хорошей форме женского и мужского здоровья -
он способен корректировать снижение содержания сперматозоидов в
семенной жидкости.
ИСТОЧНИКИ ВИТАМИНА В12
Витамин В12 является единственным витамином, синтез
которого осуществляется исключительно микроорганизмами;
ни растения, ни ткани животных этой особенностью не
наделены. Этот витамин вырабатывается в пищеварительном тракте
любого организма, мясо которых употребляется людьми в пищу, а
также в пищеварительном тракте человека. В растительных продуктах
содержится очень малое количество этого витамина. Они практически
не способны синтезировать его (несмотря на то, что иногда содержат
много кобальта, который входит в состав витамина B
12
).
Витамин B
12
человек может в первую очередь получать с животной
пищей, в том числе с мясом (особенно с печенью и почками), рыбой,
яйцами и молочными продуктами. Главным местом накопления
витамина В12 в организме человека является печень, в
которой содержится до нескольких миллиграммов витамина.
В печень он поступает с животной пищей или синтезируется
микрофлорой кишечника при условии доставки с пищей
кобальта. Так же источником витамина В
12
могут быть обогащённые
им продукты: например, таким источником являются сухие завтраки,
пивные дрожжи и пищевые дрожжи, витаминизированные хлопья и
изделия из дроблёного зерна, а также специальные добавки. Во
многих странах пищевой промышленности витамин добавляют в такие
продукты, как сухие завтраки, шоколадные батончики, энергетические
напитки.
Так же витамин В12 производится посредством бактериальной
ферментации. Для получения цианокобаламина используют
следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop,
shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и
мутанты.
Суточная потребность в витамине В12 для взрослого человека
составляет около З мкг (0,003 мг).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ОБЬЕКТАХ (ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ)
Как было установлено, витамины содержатся в продуктах
растительного и животного происхождения, поэтому важно знать
содержание витаминов в продукте.
Единого метода определения витаминов нет и не может быть, так
как химически это совершенно разные вещества, которые
объединяются лишь по своим биологическим свойствам, но в
отличие от других биологически активных веществ, они действуют не
на один какой-то орган, а на всю жизнедеятельность организма.
Специальные реакции на отдельные витамины зависят того, к какой
группе химических соединений они относятся.
Современные методы определения витаминов в биологических
объектах делят на физико-химические и биологические.
Физико-химические
Основаны на зависимости физических свойств вещества от
его природы. Физико-химические методы анализа могут
включать химические превращения определяемого соединения,
растворение образца, концентрирование анализируемого
компонента, маскирование мешающих веществ и т.д. В
отличие от "классических" химических методов анализа, где
аналитическим сигналом служит масса вещества или его
объем, в физико-химических методах анализа в качестве
аналитического сигнала используют интенсивность
излучения, силу тока, электропроводность, разность
потенциалов…
При взаимодействии витаминов с рядом химических соединений
наблюдаются характерные цветные реакции, интенсивность окраски
которых пропорциональна концентрации витаминов в исследуемом
растворе. Поэтому витамины можно определить
фотоколориметрически, например витамин В
1
– при помощи
диазореак-тива и т.д. Эти методы позволяют судить как о наличии
витаминов, так и о количественном содержании их в исследуемом
пищевом продукте или органах и тканях животных и человека. Для
выяснения обеспеченности организма человека каким-либо
витамином часто определяют соответствующий витамин или продукт
его обмена в сыворотке крови, моче или биопсийном материале.
Однако эти методы могут быть применены не во всех случаях.
Встречаются трудности при подборе специфического реактива для
взаимодействия с определенным витамином. Некоторые витамины
обладают способностью поглощать оптическое излучение только
определенной части спектра. В частности, витамин А имеет
специфичную полосу поглощения при 328-330 нм. Измеряя
коэффициент поглощения спектрофотометрически, можно
достаточно точно определить количественное содержание витаминов
в исследуемом объекте. Для определения витаминов В
1
, В
2
и других
применяют флюорометрические методы. Используют и
титриметрические методы.
Биологические методы
Методы качественного обнаружения и количественного
определения неорганических и органических соединений,
основанные на применении живых организмов в качестве
аналитических индикаторов. Живые организмы всегда
обитают в среде строго определенного химического
состава. В биологических методах анализа
устанавливаются связи характера и (или) интенсивности
ответного сигнала с кол-вом определяемого компонента. В
качестве индикаторов применяются микроорганизмы
(бактерии, дрожжи, плесневые грибы), водоросли и высшие
растения, водные беспозвоночные и позвоночные животные
(простейшие, ракообразные, моллюски, личинки комаров,
олигохеты, пиявки, рыбы., насекомые, черви, а также ткани,
различные органы и системы (нервная, кровеносная, половая
и др.) теплокровных. Питательная среда может быть
естественной, искусственной или синтетической.
Биологические методы основаны на определении того минимального
количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете,
лишенной только данного изучаемого витамина, предохраняет
животное от развития авитаминоза или излечивает его от уже
развившейся болезни. Это количество витамина условно принимают
за единицу (в литературе известны «голубиные», «крысиные»
единицы). Большое место в количественном определении ряда
витаминов: фолиевой, пара-аминобензойной кислот и др. – в
биологических жидкостях, в частности в крови, занимают
микробиологические методы, основанные на измерении скорости
роста бактерий; последняя пропорциональна концентрации витамина
в исследуемом объекте. Количество витаминов принято выражать,
кроме того, в миллиграммах, микрограммах, международных единицах
(ME, или IU).
Из пищевых продуктов витамины выделяют, используя полярные и
неполярные растворители. Для разделения витаминов используются
хромотаграфические методы - разделение и анализ смесей
анализируемых веществ сорбционными методами в динамических
условиях. Метод основан на различном распределении веществ
между двумя несмешивающимися фазами - подвижной и
неподвижной.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В12 РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ
Рассмотрим возможность применения этих методов для
определения цианокобаламина в биологических обьектах.
Применение физико-химических методов
Хроматография
Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции
по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование
клеток, экстрагирование водой при рН 4,5-5,0 и температуре 85-90?С,
в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита),
Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор
охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добавляют
коагулянты белка - хлорид железа трехвалентного и алюминия
сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и
дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и
хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3-
4С из водно-ацетонового раствора.
Итак, в данном случае в качестве аналитического метода используют
тонкослойную хроматографию. Этот тип определения отличается
простотой осуществления и экономией времени. Он основан на том,
что растворимость биологически активных веществ весьма различна.
Знание этой величины играет большую роль как при экстракции, так и
при нанесении и разделении. Водорастворимые витамины на
высушенном слое силикагеля значительно стабильнее
жирорастворимых витаминов, что облегчает нанесение и
количественное определение.
Условия разделения и результаты
При использовании смеси Генсхирта и Мальзахера на силикагеле
цианкобаламин остается в точке старта (см. табл. 1), а водой
перемещается (Rf * 100 е^22).
Обнаружение и возможности определения
ВИТАМИН
Rf * 100 ОКРАСКА
ГРАНИЦЫ
ОПРЕДЕЛ
Уксусная
к-та-
ацетон-
метанол
вода в УФ-свете
(254мм)
в УФ-свете
(365мм)
дневной
свет
В12
(циклокобаламин)
0 22 тёмная фиолетова красная 1-0,5-0,3
Табл 1. Ориентировочная величина Rf x 100 и непосредственное обнаружение
витамина В12 с использованием различных источников освещения
на слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой
Рис. 2. Одномерная хроматограмма водорастворимых витаминов.
Разделение водой на слое силикагель + флуоресцентный индикатор (время анализа около
40 мин); снято в коротковолновом УФ-свете. 1 — 30 мг тиамина • НС1; 2 — 3 мг
рибофлавина;7—10 дг цианокобаламина