Контрольная работа - Культивирование аэробных микроорганизмов
Подождите немного. Документ загружается.
План
1. Положение микроорганизмов в системе живого мира……………………….2
2. Отношение к молекулярному кислороду……………………….……………...2
3.Питание микроорганизмов……………………………………………………….5
4.Питательные среды для культивирования бактерий…………………………….6
4.1.Классификация сред……………………………………………………….…….6
4.2.Характеристика серед……………………………………………………………7
5. Посев и культивирование………………………………………………………...9
5.1. Получение изолированных колоний………………………………………….9
5.2.Температура культивирования……………………………………………......10
5.3. Состав газовой среды………………………………………………………..10
5.4. Методы культивирования……………………………………………………..10
6.Первичная идентификация бактерий…………………………………………....12
6.1. Гемолиз……………………………………………………………………….12
6.2.Размеры и форма колоний…………………………………………………….13
6.3. Цвет колоний…………………………………………………………………..13
6.4.Консистенция колоний и особенности роста на среде…………………….14
6.5.Запах……………………………………………………………………………14
Литература……………………………………………………………………….....15
1.Положение микроорганизмов в системе живого мира
1
Начиная с Аристотеля (384—322 до н. э.), которому принадлежит первая
попытка систематизировать накопленные к тому времени сведения об организмах, биологи
делили живой мир на два царства — растений и животных. А. ван Левенгук, открывший мир
микроскопических живых существ, был убежден в том, что они являются "маленькими
живыми зверушками". С этого времени и до XIX в. все открываемые микроорганизмы
рассматривали как мельчайшие существа животной природы.
Во второй половине XIX в. немецкий биолог Э. Геккель (1834—1919) приходит к
заключению, что микроорганизмы настолько существенно отличаются как от царства
животных, так и от царства растений, что не укладываются ни в одно из этих подразделений.
Э. Геккель предложил выделить все микроорганизмы, у которых отсутствует
дифференцировка на органы и ткани (простейшие, водоросли, грибы, бактерии), в отдельное
царство Protista (протисты, первосущества), включив в него организмы, во многих
отношениях занимающие промежуточное положение между растениями и животными.
Термин "protista" и сейчас применим для обозначения объектов, исследуемых
микробиологами.
По-гречески protos — самый простой.
Дальнейшее изучение геккелевских "первосуществ" выявило неоднородность этой
группы. Тогда же стало ясно, что понятие "микроорганизм" не имеет таксономического
смысла. Оно объединяет организмы по признаку их малых (как правило, видимых только с
помощью соответствующих приборов) размеров и связанных с этим специфических методов
изучения.
Данные о различии в строении клеток микроорганизмов, входящих в группу Protista,
начали накапливаться с конца XIX в, Это повлекло за собой деление группы на высшие и
низшие протисты. К высшим протистам стали относить микроскопических животных
(простейших), микроскопические водоросли (кроме сине-зеленых) и микроскопические
грибы (плесени, дрожжи), к низшим — все бактерии и сине-зеленые водоросли (последние
чаще называют теперь цианобактериями). Деление на высшие и низшие протисты
происходило в соответствии с двумя выявленными типами клеточной организации —
эукариотной и прокариотной. Высшие протисты имеют эукариотное строение клеток, т. е.
являются эукариотами, низшие — прокариотное.
2. Отношение к молекулярному кислороду
Кислород широко распространен в природе, находясь как в связанном, так и
свободном состоянии. В первом случае он входит в состав молекул воды, органических и
неорганических соединений. Во втором — присутствует в современной атмосфере в виде
молекулярного кислорода (O
2
), объемная доля которого составляет 21%. Кислород является
2
обязательным химическим компонентом любой клетки. Подавляющее большинство
организмов удовлетворяет свои потребности в этом элементе, используя обе формы
кислорода. При выращивании, Pseudomonas в присутствии O
2
и H
2
O источником
приблизительно 10% кислорода, входящего в состав клеточного материала, служил
газообразный кислород, 50–60% клеточного кислорода происходило из воды. Остальной
кислород в клетку поставляли органические и неорганические компоненты питательной
среды (глюкоза, фосфаты, нитраты, сульфаты и др.).
Рис. 1. Группы прокариот в зависимости от отношения к молекулярному
кислороду.
Среди прокариот существуют значительные различия в отношении к
молекулярному кислороду. По этому признаку они могут быть разделены на несколько
групп. Прокариоты, для роста которых O
2
необходим, называют облигатными
(обязательными) аэробами. К ним относится большинство прокариотных организмов. Среди
облигатных аэробов обнаружены существенные различия в отношении к уровню
молекулярного кислорода в среде. Некоторые представители этой группы не способны к
росту при концентрации O
2
, равной атмосферной, но могут расти, если содержание O
2
в
окружающей среде будет значительно ниже (порядка 2%). Такие облигатно аэробные
прокариоты получили название микроаэрофилов.
Потребность прокариот в низкой концентрации O
2
в окружающей среде связана с
их метаболическими особенностями. Многие аэробные азотфиксирующие бактерии могут
расти в среде с молекулярным азотом только при концентрации O
2
ниже 2%, т. е. как
микроаэрофилы, а в присутствии связанного азота, например аммонийного, — на воздухе.
Это объясняется ингибирующим действием молекулярного кислорода на активность
нитрогеназы — ферментного комплекса, ответственного за фиксацию Na. Аналогичная
картина обнаружена у многих водородокисляющих бактерий. На среде с органическими
соединениями в качестве источника энергии они хорошо растут при атмосферном
содержании O
2
. Если источником энергии является окисление молекулярного водорода, эти
же бактерии для роста требуют низкой концентрации O
2.
Последнее связывают с
инактивацией молекулярным кислородом гидрогеназы — фермента, катализирующего
использование H
2
.
3
Наконец, среди облигатных аэробов существуют значительные различия в
устойчивости к высоким уровням O
2
в среде. 100%-ный молекулярный кислород подавляет
рост всех облигатных аэробов. Многие аэробные бактерии могут формировать колонии на
поверхности твердой питательной среды в атмосфере, содержащей 40% O
2
, но рост их
прекращается, когда содержание СO
2
в атмосфере повышается до 50%.
Хотя облигатно анаэробные бактерии в целом очень чувствительны к O
2
, они могут
в природе находиться в аэробных зонах. Широкое распространение представителей рода
Clostridium в местах с высоким парциальным давлением O
2
объясняется наличием у них
эндоспор, не чувствительных к молекулярному кислороду. Однако и многие не образующие
спор строго анаэробные прокариоты обнаружены в природе в местах, где наблюдается
активное развитие облигатных аэробов. Вероятно, совместное развитие с облигатными
аэробами, активно потребляющими молекулярный кислород, приводящее к образованию зон
с низкой концентрацией O
2
, создает возможности и. для развития строго анаэробных видов.
Описаны прокариотные организмы, которые могут расти как в аэробных, так и в
анаэробных условиях. Изучение этого явления показало, что природа его различна.
Бактерии, не нуждающиеся в O
2
(последний не участвует в осуществляемых ими
метаболических реакциях), но способные расти в его присутствии, являются по типу
осуществляемого ими метаболизма облигатными анаэробами, устойчивыми к O
2
внешней
среды. Примером таких организмов служат молочнокислые бактерии. Многие прокариоты,
относящиеся к этой же группе, приспособились в зависимости от наличия или отсутствия O
2
в среде переключаться с одного метаболического пути на другой, например с дыхания на
брожение и наоборот. Такие организмы получили название факультативных анаэробов, или
факультативных аэробов. Представителями этой физиологической группы прокариот
являются энтеробактерии. В аэробных условиях они получают энергию в процессе дыхания.
В анаэробных условиях источником энергии для них служат процессы брожения или
анаэробного дыхания.
Среди факультативных анаэробов в условиях осуществления ими метаболизма
аэробного типа также могут быть микроаэрофилы.
Потребность в O
2
у аэробов определяется его участием в энергетических и
конструктивных процессах. В первом случае O
2
служит обязательным конечным акцептором
электронов, во втором — участвует в реакциях (или единственной реакции) на пути
многоступенчатого преобразования клеточных метаболитов или экзогенных субстратов. У
облигатных аэробов большая часть O
2
используется в качестве конечного акцептора
электронов в реакциях, катализируемых цитохромоксидазами. Меньшая часть включается в
молекулы с помощью ферментов, получивших общее название оксигеназ.
4
3. Питание микроорганизмов
Для роста и размножения бактерии нуждаются в питательных веществах: им
необходимы источники углерода, азота, витамины и минералы, и другие соединения
сложного и простого состава. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение,
являются гетерохемоорганотрофами, которые питаются по законам осмоса. Среди бактерий
встречаются как легко культивируемые, так и требовательные к питательным веществам
микроорганизмы (прихотливые), которым необходимы дополнительные факторы роста.
Организмы, получающие энергию с помощью фотосинтеза или путём окисления
неорганических соединений, способны в большинстве своём использовать СО
2
в качестве
главного источника углерода. Эти С-автотрофные организмы восстанавливают СО
2.
Все
остальные организмы получают клеточный углерод главным образом из органических
веществ. Последние, как правило, служат источниками как энергии, так и углерода;
частично они ассимилируются для построения клеток, частично окисляются для получения
энергии.
Помимо элементов минерального питания и источников углерода и энергии
многие организмы нуждаются ещё в некоторых дополнительных веществах, называемые
факторами роста. Эти вещества входят в основной состав клетки, но некоторые организмы
не способны их синтезировать сами. Это аминокислоты, пурины, пиримидины и витамины.
Аминокислоты, пурины, пиримидины - составные части белков и нуклеиновых кислот и
клетка нуждается в достаточных количествах этих соединений. Витамины входят в состав
коферментов или простетических групп, участвуя в каталитических функциях.
Большинство микроорганизмов способны поглощать серу и азот в виде
сульфата и нитрата, которые они могут восстанавливать. Обычный источник азота для
микроорганизмов - соли аммония. Некоторые прокариоты способны восстанавливать
молекулярный азот; другие в качестве источника азота нуждаются в аминокислотах, в
которых азот содержится уже в связанном виде. Не все микроорганизмы могут
восстанавливать сульфат; некоторым в качестве источника серы нужен сероводород или
цистеин.
4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов
5
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные
соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения
бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.
Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям:
- содержать все необходимые для размножения определённых микроорганизмов
вещества в легкоусвояемой форме;
- иметь оптимальную влажность;
- влажность и рН
- быть изотоничной и по возможности прозрачной.
Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для
их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на
различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не
растущие in vitro вне клеточных культур. Используемая среда должна содержать вещества,
утилизируемые бактериями для различных биосинтетических процессов
Универсальные источники азота и углерода — белковые гидролизаты (содержат
полный набор аминокислот), пептиды и пептоны. Универсальные источники витаминов и
микроэлементов экстракты белков животного или растительного происхождения и белковые
гидролизаты.
рН среды. В некоторых случаях жизнедеятельность бактерий сопровождается
сдвигом рН в кислую или щелочную сторону, что требует внесения в среды различных
буферных систем (обычно применяют фосфатный буфер). Сбалансированные среды
отличают высокая буферность и стабильный оптимум рН. Важно так же создание
оптимальной концентрации О
2
и СО
2
.
4.1.Классификация сред
Среды классифицируют по консистенции, составу, происхождению, назначению и
загрязнённости материала.
По консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые)их готовят
путём добавления к жидкой среде 1,5-2% агара, полужидкие-0,3-0,7%агара и жидкие.
По составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды.
По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).
Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар
(МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и
соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).
6
Естественные среды могут содержать компоненты животного (например,
кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов)
происхождения.
По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и
транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий),
среды для культивирования (универсальные простые, сложные специальные и для
токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и
элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-
дифференциальные).
По загрязнённости материала. Если материал слабо загрязнён посторонней
микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды.
При обильной контаминации сапрофитами используют специальные или элективные (для
отдельных видов), селективные (только для отдельных бактерий), дифференциально-
диагностические (для облегчения идентификации) среды.
4.2.Характеристика сред
Консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост
сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига),
гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl
2
, раствор цитрата натрия и
дезоксихолата натрия (среда Бенгсанга-Эллиота).
Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон,
тиогликоливая среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт
создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее
часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические
вещества — соли жёлчных кислот, тетратионат Na
+
, теллурит К
+
, антибиотики, фуксин,
генциановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.
Элективные и селективные среды (например, среды Уйлсона-Блэра, Эндо,
Плоскирева, Мак-Конки) предназначены для первичного посева материала или для
пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой
культуры. Среды готовят с учётом биохимических и энергетических потребностей
микроорганизмов. Соответственно, выделяют кровяные и сывороточные среды
(например, Лёффлера, Бордё-Жангу), яичные среды (например, Лёвенштайна-Йенсена) и
др
Дифференциально-диагностические среды (например, среды Гисса, Кларка)
применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В
качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения,
7
гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена, дополненные
углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении
происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки)
сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной,
среды для определения индолообразования, среды для определения протеолитической
активности и комбинированные (политропные) среды. В такие среды также часто вносят
различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андраде,
бромкрезоловый пурпурный и крезоловый красный), помогающие визуально определить
изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую
сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андраде или пожелтение при
использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании реактив
Андраде и индикатор бром-тимоловый синий не меняют цвет среды. Все
дифференциально-диагностические среды разделяют на четыре основные группы.
Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием
бактериальных ферментов (кровь, желатина, молоко и др.), применяют для определения
гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространены мясопептонная
желатина (МПЖ), свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).
Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты. Ферментативное
расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и
образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами
(например, с бром-тимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда
Минкевича) и среды Гисса. Из углеводов наиболее часто используют моносахариды
(ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу,
мальтозу, сахарозу), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты
(дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).
Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят
среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый
голубой, нейтральный красный, индигокармин), а также среды с нитратами для
определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате
среды окрашиваются в синий цвет).
Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой
группой бактерий. Наиболее известны цитратный агар Симмонса и цитратная среда
Козера.
5.Методы выделения и культивирования аэробных
микроорганизмов
8
Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной
разновидности, выращенная на питательной среде. Культуры микробов одного и того же вида,
или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же
источника, называют штаммами. Чистые культуры бактерий получают из изолированных
колоний, пересевая их петлёй в пробирку с твёрдой или, реже, жидкой питательной средой.
При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на
плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом
материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике
выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах
(например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.). Для
выделения прихотливых видов в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку,
дрожжевой экстракт и др.), а также поглотители токсических метаболитов,
образующихся при росте бактерий (например, древесный уголь). Для посевов
применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.
Чистую культуру получают для проведения идентификации, т. е. определении
родовой и видовой принадлежности выделенных бактерий.
5.1. Получение изолированных колоний
Колония представляет собой изолированное скопление бактерий одного вида,
или биовара, выросших на плотной питательной среде в результате размножения одной или
нескольких бактериальных клеток. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от
друга по своей морфологии, цвету и другим признакам
Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют
модификацию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной
питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал
распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, обжигая петлю после засева
каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их.
Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи
(техника штрихового засева показана на рис. 1-13). Указанные методы пригодны для
посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.
5.2.Температура культивирования
9
Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур, оптимальных
для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение
составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и
лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni
(температурный оптимум 42 °С).
5.3. Состав газовой среды
Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере
культивирования.
Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые
факультативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но
более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На
практике их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания
в атмосфере снижается содержание кислорода и повышается содержание СО
2
.
5.4. Методы культивирования
При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ
глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В
соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на
периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при
проточном культивировании).
Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав
сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных
манипуляций.
10