Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
Подруге, мікроорганізми здатні рости на відносно простих
і дешевих поживних середовищах, які найчастіше є відходами
інших виробництв. За джерело вуглецю мікроорганізми можуть
використовувати вуглеводи, спирти, карбонові кислоти. Джере
ла азоту можуть бути трьох видів: органічні (білки, пептиди,
амінокислоти), мінеральні речовини (солі амонію, аміак), а та
кож атмосферний азот. У промислових середовищах як джере
ла органічного вуглецю і азоту найчастіше використовують різ
ні сорти крохмалю (кукурудзяний, картопляний, рисовий),
кукурудзяний екстракт, соєву муку, гідролізати біомаси дріж
джів тощо. Потреба мікроорганізмів у макро і мікроелементах
задовольняється за рахунок солей неорганічних кислот.
Потретє, важливою особливістю мікробіального одержан
ня ферментів є те, що кожен мікроорганізм містить великий на
бір ферментів. Це сприяє тому, що один і той самий вид мікро
організмів можна використовувати як продуцент для
одержання різних ферментів. Застосовуючи такий прийом, як
індукція біосинтезу ферментів, можна значно збільшити про
дукцію того чи іншого ферменту даним видом мікроорганізмів.
Суть його полягає в тому, що при введенні в поживне середови
ще певних речовин – індукторів (часто це специфічні субстрати
одержуваних ферментів) – змінюються метаболічні шляхи
в клітині так, що переважно починає синтезуватися даний
фермент.
Швидкість біосинтезу ферментів мікроорганізмами досить
висока. Але продуктивність штамівпродуцентів можна збіль
шити у 2–5 разів за допомогою селекції, підбором умов культи
вування та одержання високопродуктивних мутантних форм
мікроорганізмів. Використовуючи біотехнології рекомбінант
них ДНК, можна одержати штами мікроорганізмів, у яких вміст
ферментів досягає 50 % загальної маси синтезованого білка. Усе
це дало можливість різко збільшити виробництво ферментних
препаратів і знизити вартість ферментів приблизно у 100–1000
разів.
Так, поєднання методів мутагенезу і селекції з методами ге
нетичної інженерії дало можливість японським дослідникам до
сягти 200кратного збільшення виходу αамілази із Bacillus sub
tilis. Коли фермент здійснює гідроліз крохмалю при більш
високій температурі, то виробництво цукристих речовин при
скорюється. У зв’язку з цим було поставлене завдання збільши
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
430
ти виробництво термостабільної αамілази. Японські вчені вве
ли в сінну паличку ген синтезу цього ферменту із термофільної
бактерії, що призвело до збільшення виходу термостабільної
αамілази.
Більшість ферментів, які синтезуються мікроорганізмами, є
екстрацелюлярними продуктами і виділяються в рідке середо
вище, що оточує клітини. Це позаклітинні ферменти. У міцелії
трьохдобової культури залишається зазвичай не більше 10–15 %
ферментів. Інколи ферменти не виділяються в оточуюче середо
вище, будучи зв’язаними з клітинними органелами – внутріш
ньоклітинними ферментами. Позаклітинні ферменти є пере
важно гідролазами.
Ферменти можуть бути індукованими і конститутивними.
Індуковані – це ферменти, які синтезуються мікроорганізмами
лише в разі наявності у поживному середовищі певних речовин
або індукторів. Наприклад, фермент лактаза може синтезувати
ся тільки за наявності в середовищі лактози. Більшість гідролі
тичних ферментів належать до індукованих. Біосинтез більшо
сті з них інгібується глюкозою.
20.2. МЕТОДИ КУЛЬТИВУВАННЯ
МІКРООРГАНІЗМІВПРОДУЦЕНТІВ ФЕРМЕНТІВ
З точки зору характеру процесу культивування мікроорга
нізмівпродуцентів усі технологічні процеси виробництва фер
ментних препаратів поділяються на дві принципово різні групи:
в першому випадку ферментація ведеться глибинним методом у
рідкому поживному середовищі, а в другому – використовуєть
ся поверхнева культура, яка росте на спеціально підготовлено
му пухкому і зволоженому поживному середовищі.
Глибинний метод культивування продуцентів.
Дослідження у сфері глибинного культивування мікроорганіз
мів розпочались в нашій країні в 50х роках минулого століття.
Метод полягає у вирощуванні мікроорганізмів у рідкому по
живному середовищі. Він технічно більш досконалий, ніж по
верхневий, оскільки легко піддається механізації і автоматиза
ції. Крім цього, усі клітини культури знаходяться в однакових,
легко відтворюваних умовах. В результаті вони рівномірно
забезпечуються поживними речовинами і киснем. Глибинне
Розділ20.Біотехнолоіяодержанняферментів
431
культивування дає можливість чітко дозувати вміст у поживно
му середовищі різних компонентів. Шляхом зміни складу по
живного середовища і умов культивування можна суттєво
посилити синтез деяких ферментів.
Весь процес культивування має проводитися в належних
асептичних умовах, що, з одного боку, є перевагою методу, а з
іншого – призводить до неабияких технічних труднощів, ос
кільки найменше порушення асептики інколи є наслідком пов
ного припинення утворення ферменту. Недоліком методу є й те,
що концентрація ферменту в середовищі значно нижча, ніж у
екстрактах поверхневої культури. Фільтрати культуральної рі
дини містять не більше 3 % сухих речовин. Це викликає
необхідність попереднього концентрування фільтратів перед
виділенням ферменту.
Поверхневий метод культивування продуцентів
ферментів. При поверхневому методі культура росте на по
верхні твердого зволоженого поживного середовища. Міцелій
повністю обволікує і доволі міцно скріплює тверді частинки.
Клітини живляться за рахунок поживних речовин середовища і
використовують для дихання кисень повітря, тому для нор
мального забезпечення киснем потрібно проводити рихлення
по всій структурі середовища з невеликою висотою шару. Це
призводить до необхідності мати велику поверхню контакту
рихлого середовища з повітрям, тобто значних виробничих
площ, а за відсутності механізації вимагає і великих витрат руч
ної праці.
Крім того, тверді субстрати, які використовуються у цьому
випадку, важко піддавати стерилізації, а поверхневу культуру
складно оберігати від забруднення сторонньою мікрофлорою.
Поряд з недоліками поверхневий метод має і переваги над
глибинним. При поверхневому культивуванні відбувається
більш висока швидкість росту мікроорганізмів і досягається
більша концентрація сухих речовин. Поверхневі культури мож
на швидко і відносно легко висушити та перевести у товарну
форму. Висушену поверхневу культуру можна довго зберігати і
легко транспортувати. Дуже суттєвою перевагою є і те, що у по
верхневих культурах мікроорганізми синтезують ширший
спектр ферментів.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
432
20.3. ОДЕРЖАННЯ ТОВАРНИХ ФОРМ ФЕРМЕНТНИХ
ПРЕПАРАТІВ
20.3.1. Виділення ферментів
Наступною стадією біотехнологічного процесу одержання
ферментних препаратів є виділення цільового продукту (фер
менту). Ця стадія залежить від того, чи накопичується продукт
у клітині (внутрішньоклітинні ферменти) або він виділяється у
культуральну рідину (позаклітинні ферменти), чи продуктом є
сама клітинна маса (рис. 20.1). Найскладніше виділити фермент
(продукт), який накопичується в клітинах. Для цього клітини
необхідно відокремити від культуральної рідини і зруйнувати
(дезінтегрувати) клітинні оболонки.
Розділ20.Біотехнолоіяодержанняферментів
433
Рис. 20.1. Основні етапи відокремлення і очищення
біотехнологічних продуктів
(за Єгоровим Н.С. та ін., 1987)
Біомаса
Гомоенат
літин
попередняоброба
сепарація
дезінтерація
відоремленняпрод"т"
онцентр"вання
зневоднення
стабілізація
Цільовийпрод"т
Кльтралітин
К"льт"ральнарідина
Культура мікроорганізмів, вирощена поверхневим методом,
і культуральна рідина після глибинного культивування містять
велику кількість баластних речовин: біомасу продуцента, неви
користані компоненти поживного середовища, продукти мета
болізму. Частка ферментів становить майже 1 % для поверхне
вих і не більше 0,1 % — для глибинних культур.
Часто для подальшого використання ферментів їх потрібно
виділити й очистити. Ці процеси трудомісткі і коштують дорого.
Виділення ферментів – це комплекс прийомів, які дають
змогу отримувати ферментні препарати, придатні для викори
стання у наукових дослідженнях, медицині і в біотехнології.
Виділення позаклітинних ферментів. Позаклітинні фер
менти одержують із культуральної рідини після сепарації, тоб
то після розділення культуральної рідини і біомаси мікробних
білків. Інколи сепарації передує спеціальна обробка культури –
зміна рН, нагрівання, додавання коагулянтів білків для більш
ефективного відокремлення біомаси і стабілізації продуктів. Є
різні методи сепарації.
1. Флотація. Метод може бути використаним, якщо клі
тини продуцента в біореакторі накопичуються у поверхневих
шарах рідини. Флотатори різних конструкцій зціджують, відка
чують або зскрібають піну, яка містить мікробні клітини.
2. Фільтрація. Усі існуючі типи фільтрів (барабанні, ди
скові, стрічкові тощо) використовують один і той самий прин
цип – затримання біомаси на пористій фільтруючій поверхні.
3. Центрифугування. Метод ґрунтується на осаджуванні
частин, які знаходяться у завислому стані в рідині з використан
ням центробіжної сили. Центрифугування вимагає більш доро
гого обладнання, ніж фільтрування.
У деяких виробничих процесах центрифугування і фільтра
ція використовуються комбіновано – у фільтраційних центри
фугах.
Виділення внутрішньоклітинних ферментів. Внутріш
ньоклітинні ферменти виділяють після руйнування (дезінте
грації) клітин.
Методи руйнування клітин. Для руйнування клітин
застосовуються різні методи: механічні, фізичні, хімічні, біоло
гічні й ензиматичні. Іноді для досягнення дезінтеграційного
ефекту вдаються до сильних і надсильних впливів. Іноді засто
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
434
сування одного методу не дає бажаного результату. У такому
разі клітини мікробів обробляють комплексно.
Механічні методи – це балистичний, екструзивний і деком
пресійний.
Фізичні методи – осмотичний шок, термошок, плазмоліз,
заморожуваннявідтаювання, висушування клітин, ультразвук,
іонізуюча радіація.
Хімічні методи – дія кислот, лугів, солей органічних роз
чинників, поверхневоактивних речовин.
Ензиматичні методи – дія лізоциму та інших літичних
ферментів.
Біологічні – інгібування біосинтезу клітинної оболонки, дія
фагів, одержання мутантних форм мікроорганізмів–продуцен
тів ферментів із легкоруйнівними стінками.
Фізичні способи дезінтеграції більш економічні, ніж хімічні
і біологоферментативні, бо не використовуються дорогі реак
тиви і ферментні препарати. Але вони можуть негативно впли
вати на якість продукту.
Перспективним для дезінтеграції мікроорганізмівпроду
центів вважається використання іммобілізованих ферментів.
Наступним за дезінтеграцією є етап відокремлення фраг
ментів клітинних стінок. Використовуються для цього ті самі
методи, що й при сепарації клітин – фільтрація і центрифугу
вання.
20.3.2. Очищення ферментних препаратів
У деяких випадках ферментні препарати використовують у
неочищеному вигляді: у шкіряній і спиртовій промисловості
ступінь очищення не впливає на якість готової продукції, а у
тваринництві введення біомаси продуцента і домішок в корми
навіть підвищує їх поживну цінність. Натомість, у харчовій і
мікробіологічній промисловості, в медицині можуть використо
вуватися тільки достатньо очищені і навіть високоочищені фер
менти. У процесі очищення відбувається підвищення питомої
активності препарату. На прикладі Asp. oryzae показано залеж
ність активності αамілази від ступеня очищення препарату
(табл. 20.3).
Розділ20.Біотехнолоіяодержанняферментів
435
З методів, які дають змогу одержувати ферментні препара
ти необхідного ступеня чистоти, широко використовується ме
тод розділення, який базується на неоднаковій розчинності
білків.
Розділення найчастіше проводять шляхом осаджування
білківферментів без втрати їх каталітичної активності. Осад
жувати розчинні ферменти можна фізичними або хімічними
впливами. Фізичні – нагрівання, охолодження, розбавлення або
концентрування розчину. Із хімічних речовин для осаджування
використовують солі неорганічних кислот і частіше сульфат
амонію, а також органічні розчинники (етанол, ацетон, діоксан,
поліетиленгліколь, декстран).
Високого ступеня чистоти ферментів досягають за допомо
гою хроматографії (адсорбційної, гідрофобної, ковалентної,
іонообмінної, роздільної та гельхроматографії), яка проводить
ся на гелях агарози, поліакриламіду, фосфату кальцію, а також
на оксиді Al, силікагелі, крохмалі, целюлозі тощо.
Із інших методів виділення й очищення використовуються:
гельфільтрація – це фракціонування ферментів за їх
молекулярною масою за допомогою сефадексів, біогелів, ульт
рагелів;
зональношвидкісне центрифугування в градієнті щіль
ності (цукрози, гліцерину, декстрану, глікогену, білків тощо);
електрофорез – коли розчин ферменту поміщають у силь
не електричне поле, яке приводить в рух його іонізовані компо
ненти;
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
436
Таблиця20.3.
Послідовність очищення
αα
амілази Asp. oryzaе
Стадіяочищення
Мара
препарат"
АтивністьЕ/
АСР
Поверхнева"льт"рариба
Пх
38
Упаренийводнийестратіз"льт"ри
П2х
120-140
Осадженняетаноломізестрат"
П10х
600-800
Осадженняетаноломіздіалізованоо
естрат"
П15х
1300-1400
Повторнаристалізація
П20х
2000-2500
Кристалічнаα-амілаза
6600
ізоелектрофокусування – фермент фокусується у зоні, ве
личина рН якої дорівнює його ізоелектричній точці.
З перелічених методів розділення і очищення ферментів
лише деякі (іонообмінна і афінна хроматографія) впроваджені у
крупнотоннажне виробництво. Перспективним для очищення
ферментів є застосування водних двохфазових систем, які
містять полімери, які стабілізують фермент, що дає змогу не за
стосовувати низькі температури.
20.3.3. Концентрування ферментів
Цей процес завершує стадії виділення і очищення. На цій
стадії відбувається остаточне виділення вологи з продукту.
Концентрування розбавлених білкових розчинів здійснюється
такими методами: ультрафільтрацією – це фільтрація під
тиском через мембрани, які діють за принципом молекулярного
фільтра; випарюванням під вакуумом; ліофільним сушін
ням – висушуванням при низьких температурах під вакуумом;
осаджуванням сульфатом амонію.
Після концентрування препарат має містити не більше
68 % вологи. У цьому випадку термін його зберігання без втра
ти каталітичної активності становить один рік.
У процесі виділення й очищення фермент може інактивува
тись. Тому всі процеси проводяться при низьких температурах
і за присутності різних стабілізуючих агентів: субстратів, ко
факторів, комплексоутворювачів, відновлюючих агентів.
20.3.4. Стандартизація ферментних препаратів
Стандартизацією називають операцію з доведення активно
сті препарату до стандартної, яка визначена ДЕСТ або техніч
ними умовами. Для цього використовують різні нейтральні на
повнювачі. Частіше це крохмаль, лактоза, харчова сіль.
Препарат і наповнювач ретельно перемішують.
Оскільки ферменти є речовинами білкової природи, то в су
міші з іншими білками визначити їх кількість практично нем
ожливо. Наявність ферменту в препараті може бути встановлена
лише за перебігом тієї реакції, яку каталізує фермент. Кількісну
характеристуку можна дати за кількістю утворених продуктів
реакції або за кількістю витраченого субстрату за контрольова
них (стандартних) умов проходження реакції (температура, рН
Розділ20.Біотехнолоіяодержанняферментів
437
середовища, концентрація субстрату тощо). За рішенням Між
народного біохімічного союзу була прийнята так звана стан
дартна одиниця активності (Е) – це кількість ферменту, яка
каталізує перетворення одного мікромоля субстрату за 1 хв при
заданих стандартних умовах.
Активність ферментного препарату виражається в мікро
молях субстрату, який прореагував під дією 1 мл ферментного
розчину або 1 г препарату в оптимальних умовах за 1 хв. Якщо
ферментний препарат не містить баласту, його активність вира
жається в тих самих стандартних одиницях на 1 мг ферменту.
Якщо ж баласт є, то активність розраховується на 1 мг білка у
ферментному препараті. Активність ферментного препарату,
який випускає завод, є одним з найважливіших нормованих по
казників його якості.
20.3.5. Ідентифікація і індексація ферментних препа
ратів
Для ідентифікації ферментних препаратів, які випускають
ся мікробіологічною промисловістю, використовують цифрову
і буквену індексацію: Пх; П3х; П5х; П10х; П15х; П20х та Гх; Г3х;
Г5х; Г10х; Г15х; Г20х. Перші букви «Г» або «П» вказують на спо
сіб культивування продуцента – поверхневий або глибинний.
Наявність ферменту у препараті позначається буквою «Х». На
ступні за буквами «П» або «Г» цифри показують ступінь очи
щення ферменту в процесі його одержання – чим вище очищен
ня, тим більше число.
«Пх» або «Гх» – це технічні ферментні препарати, які мі
стять 1–5 % цільового ферменту від маси білка, що синтезуєть
ся, і велику кількість баластних речовин: біомасу продуцента,
компоненти поживного середовища, продукти метаболізму.
20.4. ПРОМИСЛОВІ ФЕРМЕНТНІ ПРЕПАРАТИ
В сучасних промислових технологічних процесах велике
значення мають гідролітичні ферменти. Однією із суттєвих пе
реваг порівняно з іншими класами ферментів є їх здатність здій
снювати ферментативні реакції без кофакторів і коферментів. У
багатьох виробництвах гідролази замінили процес кислотного
гідролізу. Їх висока специфічність дає змогу одержувати готові
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
438
продукти з мінімальною кількістю сторонніх речовин без зміни
вихідних смаку й аромату.
Найчастіше використовуються такі групи ферментів:
Амілолітичні ферменти – αамілаза і глюкоамілаза. Суб
стратом для них є крохмаль. Амілаза розщеплює крохмаль до
більш простих поліцукрів – декстринів, а глюкоамілаза – дек
стрини і крохмаль до глюкози. Ці ферменти використовуються
у харчовій, спиртовій промисловості та у тваринництві.
Протеолітичні ферменти утворюють клас пептидгідролаз
(протеаз). Їх дія полягає у прискоренні гідролізу пептидних
зв’язків у білках і пептидах. Важлива їх особливість – вибірко
ва, селективна дія на пептидні зв’язки у білковій молекулі. На
приклад, пепсин діє тільки на зв’язок з ароматичними кислота
ми, трипсин – тільки на зв’язок між аргініном і лізином.
Ферментів цього класу дуже багато. В промисловості їх
класифікують за здатністю проявляти активність у певній обла
сті рН: рН 1,5–3,7 – кислі протеази; рН 6,5–7,5 – нейтральні
протеази; рН → 8,0 – лужні протеази.
Використання протеаз широке: м’ясна промисловість – для
розм’якшення м’яса; шкіряна промисловість – при видаленні
шерсті (волосся) та розм’якшенні шкір; кіновиробництво; пар
фумерія – добавки у зубну пасту, креми, лосьйони; промисло
вість синтетичних миючих засобів; медицина – при лікуванні
запальних процесів, опіків, тромбозів; тваринництво – домішки
до раціонів сільськогосподарських тварин.
Пектолітичні ферменти (пектинази) – гідролізують
пектинові речовини з утворенням органічних кислот. Викори
стовуються: в текстильній промисловості – вимочування льону
перед переробкою; у виноробстві – освітлення вин, знищення
муті; у консервуванні – для виготовлення фруктових соків; у
тваринництві – домішка до раціонів тварин для покращення пе
ретравлення поживних речовин.
Целюлолітичні ферменти (целюлази) дуже специфічні, їх
дія проявляється тільки у деполімеризації молекул целюлози.
Зазвичай вони діють у вигляді комплексу, який в цілому доводить
гідроліз целюлози до глюкози. Їх використання є дуже перспек
тивним: в гідролізній промисловості – це отримання глюкози із
целюлози; в медицині – виділення лікарських речовин (стероїдів)
з рослин; у харчовій – покращення якості рослинних масел; у
сільському господарстві – як домішки у комбікорми для жуйних.
Розділ20.Біотехнолоіяодержанняферментів
439