83
83
Копропорфирин 1 является необычным примером очень узкой естественной спектральной
полосы поглощения. Большинство же клинических процедур лабораторной биохимии использует
поглощение молекул, для которых естественная полоса составляет от 40 до 200 нм и более.
Естественная полоса NADH - 58 нм (λ
макс
= 339 нм). Было бы идеально использовать для точных
измерений этого вещества спектральную полосу 6 нм или меньше. Фактические исследования
показали, что использование спектральный полосы 10 нм на 340 нм дает измеренную амплитуду
поглощения в 98% от величины поглощения, полученной в полосе 1 нм.
Измерения обычно проводятся на длине волны максимума поглощения из соображений
получения наибольшей чувствительности исследования.
Это связано с тем, что при максимальном
ε максимальна чувствительность фотометрического определения изменений концентрации
аналита (см. рисунок 59).
Однако, иногда желательно выбрать другую длину волны, чтобы минимизировать влияние
других веществ на правильность измерения. Например, турбидиметрическая чувствительность
больше в синей области спектра, чем в красной. Тем не менее, иногда именно красная область
предпочтительнее для турбидиметрических исследований, чтобы избежать поглощения света
билирубином (460 нм) или гемоглобином (417 - 575 нм). Раствор, полученный в процедуре c
щелочным пикратом для креатинина, имеет относительно плоский максимум в видимой области
приблизительно на 480 нм, но реактив в бланке сам сильно поглощает свет в области меньше 500
нм. Компромисс находится выбором длины волны 520 нм, где минимизируется вклад бланка.
Значения бланка должны, конечно, поддерживаться минимальными. Небольшая разница между
двумя большими величинами поглощения приводит к существенной неопределенности.
Следовательно, уменьшение поглощения бланка улучшает точность и правильность измерения.
Линейный рабочий диапазон метода может быть расширен измерениями не в максимуме
поглощения. Предпочтительно, однако, не проводить измерения на крутом склоне спектральной
кривой поглощения, так как небольшая ошибка в установке длины волны спектрофотометра
может привести к существенной ошибке в измерении поглощения (рис.91).
Рис. 91. 2 типа измерения с использованием
узкополосного светофильтра: на максимуме
пропускания и при длине волны, отличной от
максимального пропускания.
При измерении на максимуме пропуская ошибка в
установке длины волны (∆λ, которая может быть в
пределах допустимой) практически не будет влиять на
правильность измеренной оптической плотности
(∆D
макс
). При измерении на длине волны, отличной от
максимального пропускания, ошибка в установке
длины волны - существенный фактор в вариации
измеренной абсорбции (∆A
i
)
ФИЛЬТРЫ.
Стеклянный абсорбционный фильтр
Стеклянный абсорбционный фильтр - самый простой тип фильтра, это тонкое цветное
стекло. Некоторые металлические соединения и соли, растворенные или взвешенные в стекле,
окрашивают его в цвет, соответствующий длинам волн света прошедшего сквозь стекло. Строго
говоря, стеклянный абсорбционный фильтр не является монохроматором, потому что пропускает
свет в относительно широком диапазоне длин волн. Спектральная чистота фильтра или другого
спектрального элемента обычно описывается в терминах спектральной полосы. Спектральная
полоса определяется, как ширина (в нанометрах) спектральной кривой пропускания на уровне
половины от максимального пропускания (рисунок 92а). Обычно используемые стеклянные
фильтры из цветного стекла имеют спектральную полосу больше 50 нм и относятся к
широкополосным фильтрам.