Долгов В.В. Фотометрия в лабораторной практике

Подождите немного. Документ загружается.

Рисунок 28.

Структурная формула стереоизомеров глюкозы.

Оптически активным является 2 атом углерода

D- и L-изоформы сахаров имеют асимметричные атомы углерода, связанные с разными

группировками, поэтому обладают способностью вращать плоскость поляризованного луча. На

этом основано определение D-глюкозы в моче с помощью поляриметра. Угол вращения плоскости

поляризации зависит от оптической толщины раствора и концентрации глюкозы в растворе.

Поляриметр.

Основной частью любого прибора для поляриметрического анализа является источник

поляризованных лучей (поляризатор) и измеритель угла поляризации (анализатор). В качестве

поляризаторов и анализаторов используется специальная призма Николя, изготавливаемая из

исландского шпата и называемая кратко николь.

На рисунке 29 приведена схема простейшего поляриметра.

Рис. 29. Схема простейшего поляриметра. 1 - поляризатор; 2 – пластинка бикварца; 3 – кювета с

раствором; 4 – анализатор.

При использовании простейшего поляриметра анализатор настраивают на «темноту»,

вращая его вокруг продольной оси. Затем вносят в прибор кювету с исследуемой жидкостью. При

этом наблюдается просветление поля окуляра вследствие вращения плоскости поляризации

раствором. Поворачивая анализатор, добиваются нового потемнения поля, причем угол поворота

анализатора соответствует углу вращения раствором плоскости поляризации. Для более точного

определения момента затемнения поля окуляра применяют дополнительную пластинку 2,

состоящую из двух пластинок левовращающего и правовращающего кварца (так называемая

пластинка бикварца).

Если николи взаимно параллельны (свет проходит полностью), то пластинка бикварца

окрашена в серовато-фиолетовый цвет. При малейшем повороте анализатора обе половинки

бикварца меняют свою окраску: одна становится синей, а другая – красной. Таким образом

фиксируется малейший поворот анализатора.

Угол вращения β плоскости поляризации зависит от толщины слоя b, концентрации

раствора С и удельного вращения плоскости поляризации α– характеристического свойства

оптически активного вещества:

β = α b С.

Для концентрации это выражение преобразуется к виду:

В качестве примера поляриметра можно привести измеритель глюкозы поляриметрический

ИПГ-01. Прибор предназначен для измерения содержания глюкозы и следов фруктозы в моче при

обследованиях населения в лечебных учреждениях и в быту для контроля состояния больных

сахарным диабетом. Он также может применяться для измерения концентрации сахара, глюкозы,

фруктозы, камфоры, винной кислоты, никотина, кодеина, мальтозы, ментола, адреналина и других

оптически активных веществ в растворах пищевых продуктов, лекарствах, свекловичном соке,

фруктовых соках, сиропах, различных химических веществах.

Рассеяние света. Мутные среды.

Если поместить мутный раствор в кювету фотометрического прибора, то световой поток,

проходя через кювету, будет поглощаться (если раствор окрашен), частично проходить через

кювету, не изменяя направления (трансмиссия), частично рассеиваться, изменяя свое направление,

отклоняясь под различными углами (рассеивание). Трансмиссия и рассеяние света зависят от

длины волны светового потока, его частоты, интенсивности, а также от свойства рассеивающей

среды: размера частиц, их формы, количества, способности к поляризации и др. Если в процессе

измерения размер частиц в растворе будет меняться (например, в результате взаимодействия

антиген-антитело), то будет соответственно меняться поток проходящего и интенсивность

рассеянного света.

Определение светорассеивания.

Характер (тип) рассеивания зависит от соотношения длины волны света (λ) и диаметра

частицы, на которой происходит рассеивание (рис.36). Если размер частиц рассеивающей

реакционной смеси значительно меньше длины волны светового потока, проходящего через

кювету (диаметр частиц < λ/10), такой вид рассеяния называют упругим.

Интенсивность потока рассеиваемого небольшими частицами подчиняется уравнению

Релея:

)cos1(

)2(

+⋅⋅

−

⋅=

где I

и I

соответственно интенсивность рассеянного и падающего света, n

и n –

коэффициенты преломления частиц и среды; N – общее число частиц; V – объем частиц; λ– длина

волны падающего света; d – расстояние до наблюдателя; β – угол, образованный падающим и

рассеянным светом.

При лабораторных исследованиях величины V, n

, n, λ, d и β известны и постоянны для

исследуемого вещества, а

bCN ⋅=

; здесь C – концентрация вещества, b – толщина раствора

(также известная величина). Поэтому для определенного угла β формула Релея примет вид:

Сk

⋅=

, где все известные параметры объединены в коэффициент k.

В основе рассеяния на малых частицах лежит явление дифракции. Рассеивание света

каждой частицей не зависит друг от друга, рассеянный свет распространяется во всех

направлениях, однако максимальное количество света рассеивается под углом 0 и 180 градусов к

лучу, падающему на частицу (рис. 30А). При длине волны 400 нм такой тип рассеивания будет

характерен для частиц диаметром менее 40 нм. К таким частицам в плазме крови относятся многие

плазменные белки, в том числе иммуноглобулины, β−липопротеиды, альбумин и т.д. При

увеличении размеров частиц (для плазменных белков размер в диапазоне от ∼ 40 до 400 нм)

рассеивание становится несимметричным и максимальное количество света рассеивается в

направлении падающего луча (рис 30Б). Такой тип рассеивания будет характерен при λ 400 нм для

IgM, хиломикронов и формирующихся комплексов антигенов с иммуноглобулинами. Когда

размер частиц превышает длину волны света (в нашем примере диаметр больше 400 нм)

несимметричность светорассеяния еще больше увеличивается (рис 30В). Такой тип рассеивания

будет характерен для взвеси бактерий, для клеток крови (тромбоцитов, эритроцитов) и других

крупных частиц. Интенсивность рассеяния света определяется средним числом рассеивающих

частиц в единице.

Рис. 30. Характер рассеивания света в зависимости от соотношения диаметра рассеивающих

частиц и длины волны падающего света

Нефелометрия - измерение рассеянного света.

Сравнивая величины рассеянного и падающего света I

и I

можно определять

концентрацию веществ в растворе. Такой метод исследования называется нефелометрией, а

приборы, на которых производят измерения – нефелометрами.

На рисунке 31 представлена принципиальная схема измерения рассеянного света.

Измерение светорассеивания под разными углами (как правило, используются измерение

малоуглового рассеивания) дает информацию о размерах частиц в растворе. В то же время, если

известны размеры частиц рассеивающего вещества, то возможно по интенсивности рассеянного

света при фиксированном угле измерения определить концентрацию вещества. Методы,

основанные на взаимодействии антиген-антитело, высоко специфичны, поэтому практически во

всех случаях известно, что измеряется. Исходя из этого, приборы для нефелометрии, как правило,

программируются под измерение определенных специфических компонентов биологической

жидкости, чаще всего индивидуальных белков.

Рис. 31.Схема измерения

рассеянного света.

А - нефелометр,

регистрирующий

малоугловое рассеивание,

Б - нефелометр,

регистрирующий

рассеивание под углом 90

о,

В -турбидиметр

На рис. 32 изображена принципиальная схема отечественного нефелометра НФМ.

А – характер рассеивания света на частицах,

диаметр которых меньше, чем в 10 раз длины волны

света (d < λ / 10),

Б – характер рассеивания при d ≤ λ ,

В - характер рассеивания при d > λ

лампа

монохроматор

Кювета с образцом

биожидкости

оптические

линзы

оптические

линзы

фильтр детектора

детектор

Угол измерения

рассеивания

В Б

Рис. 32. Оптическая схема нефелометра НФМ. 1 - лампа; 2, 11 – светофильтры; 3 – стеклянная

пластинка, разделяющая свет на 2 пучка; 4 – кювета с раствором исследуемого вещества; 5 –

ловушка света; 6 – стеклянный рассеиватель; 7, 7’, 9, 9’ – линзы, 8, 8’ – уравнительные диафрагмы;

10, 10’ – ромбические призмы; 12 – окуляр.

Свет от лампы разделяется на 2 пучка – один пучок проходит через раствор исследуемого

вещества, другой через канал сравнения. В окуляре видны 2 поля – одно измерительного канала,

второе – канала сравнения. Изменяя ширину щели, добиваются равной освещенности полей.

Результат получают по калибровочным кривым, связывающим ширину щели и концентрацию

вещества. В последнее время в нефелометрах вместо обычных ламп используют лазерные

источники излучения. Лазер имеет высокую интенсивность излучения, строгую направленность

излучения и строго фиксированную длину волны излучения, что делает лазерный луч идеальным

для нефелометрических измерений.

Турбидиметрия - измерение прошедшего света.

Метод исследования светорассеивающих растворов по прошедшему через них свету

называется турбидиметрией. Для измерения световых потоков используются турбидиметры,

построенные по принципу визуальных или электрических фотометров.

При турбидиметрических исследованиях интенсивность прошедшего светового потока I

может быть определена по уравнению:

αλ+

Cbd

где I

– интенсивность падающего светового потока; I

– интенсивность потока, прошедшего через

раствор; С – концентрация рассеивающих частиц в растворе; b – толщина поглощающего слоя

раствора; d – средний диаметр рассеивающих частиц; k и α – константы, зависящие от природы

вещества и метода измерения; λ - длина волны.

При постоянных b, d, k, α и λ получим:

lg или

−

⋅= 10

- выражение, подобное закону Бугера-Ламберта-Бера для окрашенных прозрачных растворов.

Здесь t – молярный коэффициент мутности раствора или турбидиметрия.

Таким образом, интенсивность пучка (плотность потока) параллельных лучей света при

прохождении через кювету вследствие поглощения меняется по экспоненциальному закону. При

турбидиметрии проводится измерение прошедшего светового пучка, также как измеряется и

абсорбция при фотометрии (рисунок 33). Поэтому в качестве турбидиметра можно

использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов, так как этот способ

не требует особой конструкции прибора.

Рис. 33.

Турбидиметрия –

метод измерения

прошедшего через

кювету светового

потока.

Обычно при турбидиметрических исследованиях используются короткие длины волн, как

правило, 340 нм. Это связано с тем, что доля рассеянного света увеличивается обратно

пропорционально четвертой степени длины волны, соответственно при меньшей длине волны

прошедший свет будет составлять большую часть от падающего, то есть будет более

интенсивным. В то же время оптические системы, как правило, уверенно работают в ближнем

ультрафиолете при 340 нм, в более дальнем ультрафиолетовом диапазоне необходимо

использовать специальную оптику.

ПОГЛОЩЕНИЕ И ИЗЛУЧЕНИЕ СВЕТА.

При распространении через поглощающую среду электромагнитная волна

взаимодействует с веществом, изменяя его энергетическое состояние. Это взаимодействие

происходит путем поглощения веществом фотонов – квантов энергии световой волны. Таким

образом, при каждом акте поглощения фотона внутренняя энергия вещества увеличивается

дискретно – на величину энергии кванта света. Наоборот, при излучении света веществом

происходит дискретное уменьшение внутренней энергии вещества. Поглощение света некоторыми

твердыми веществами приводит к фотоэлектрическим явлениям, это позволяет достаточно просто

регистрировать световые потоки и измерять их параметры. Дискретность обмена энергии

обусловлена строением атомов вещества, его молекулярной структуры. Дискретную структуру

энергетических состояний атомов впервые описал Бор, выдвинувший два постулата, которые

легли в основу квантовой теории строения вещества.

Квантовые постулаты Бора.

Первый постулат Бора

(постулат стационарных состояний): атомная система может

находиться только в особых стационарных или квантовых состояниях, каждому из которых

соответствует определенная энергия E

. В стационарных состояниях атом не излучает.

Согласно этому постулату Бора, атом характеризуется системой энергетических уровней,

каждый из которых соответствует определенному стационарному состоянию (рисунок 34).

Механическая энергия электрона, движущегося по замкнутой траектории вокруг положительно

заряженного ядра, отрицательна. Поэтому всем стационарным состояниям соответствуют

значения энергии E

< 0. При E

≥ 0 электрон удаляется от ядра (ионизация). Величина |E

называется энергией ионизации. Состояние с энергией E

называется основным состоянием

атома.

Рис. 34. Энергетические уровни атома и условное изображение процессов поглощения и

испускания фотонов.

Второй постулат Бора

(правило частот): при переходе атома из одного

стационарного состояния с энергией E

в другое стационарное состояние с энергией E

< E

излучается

квант, энергия которого равна разности энергий стационарных состояний:

hν

= E

– E

где h – постоянная Планка. Отсюда можно выразить частоту излучения:

Если же E

> E

, то при таком переходе электрона атом поглощает такой же по величине

квант энергии.

Линейчатые спектры атомов.

Простейший из атомов, атом водорода содержит единственный электрон. Ядром атома

является протон – положительно заряженная частица, заряд которой равен по модулю заряду

электрона, а масса в 1836 раз превышает массу электрона. Еще в начале XIX века были открыты

дискретные спектральные линии в излучении атома водорода в видимой области (так называемый

линейчатый спектр). Совокупность спектральных линий атома водорода в видимой части

спектра была названа серией Бальмера. Позже аналогичные серии спектральных линий были

обнаружены в ультрафиолетовой и инфракрасной частях спектра. Согласно второму постулату

Бора, при переходе электрона с одной стационарной орбиты с энергией E

на другую

стационарную орбиту с энергией E

< E

атом испускает квант света, частота ν

которого равна

∆E

/ h:

Чтобы электрон перешел из состояния с низкой энергией E

в состояние с высокой

энергией E

< E

, он должен поглотить квант света с частотой ν

, энергия которого также

равна:

Таким образом, переход атома из одного энергетического состояние в другое

сопровождается либо высвобождением энергии (излучение), либо поглощением энергии.

Рисунок 35 иллюстрирует образование спектральных серий в излучении атома водорода

при переходе электрона с высоких стационарных орбит на более низкие.

Рис. 35. Стационарные орбиты атома водорода и образование спектральных серий.

На рисунке 36 изображена диаграмма

энергетических уровней атома водорода и указаны

переходы, соответствующие различным спектральным сериям.

Рис. 36. Диаграмма энергетических уровней атома водорода.

Показаны переходы, соответствующие различным спектральным сериям. Для первых пяти

линий серии Бальмера в видимой части спектра указаны длины волн.

Линейчатыми спектрами излучения (и поглощения) обладают все вещества в газообразном

атомарном (но не молекулярном) состоянии, причем каждое вещество обладает неповторимым

расположением спектральных линий (рисунок 37). В этом случае свет излучают атомы, которые

практически не взаимодействуют друг с другом. Это самый фундаментальный, основной тип

спектров. Поэтому атомарные спектры используются как эталоны длин волн при спектральной

калибровке спектрофотометров и при определении дисперсии и показателя преломления

различных веществ (таблица 4). Обычно для наблюдения линейчатых спектров используют

свечение паров вещества в пламени или свечение газового разряда в трубке, наполненной

исследуемым газом.

При увеличении плотности атомарного газа отдельные спектральные линии расширяются

(так как при сближении атомов энергетические уровни «расщепляются», принимая близкие к

основному уровню значения) и при очень большой плотности газа, когда взаимодействие атомов

становится существенным, эти линии перекрывают друг друга, образуя непрерывный спектр.

Таблица 4.

Обозначения и длины волн спектральных линий при определении дисперсии и

показателя преломления различных веществ

Спектральная линия элемента Условное обозначение Длина волны, нм

УФ-линия ртути i 365,1

Фиолетовая линия ртути h 404,6

Синяя линия ртути g 435,8

Синяя линия кадмия

F’

479,9

Синяя линия водорода F 486,1

Зеленая линия ртути e 546,0

Желтая линия гелия d 587,5

Желтая линия натрия D 589,2

Красная линия кадмия

C’

643,8

Красная линия водорода C 659,2

Красная линия гелия r 706,5

ИК-линия цезия S 852,1

ИК-линия ртути t 1013,9

Спектр излучения ртутной газоразрядной лампы.

Рис. 37. Линейчатый спектр ртутной газоразрядной лампы.

Спектральный анализ

Линейчатые спектры играют особо важную роль, так как их структура прямо связана со строением

атома. Эти спектры создаются атомами, не испытывающими внешних воздействий.

Главное свойство линейчатых спектров состоит в том, что длины волн (или частоты) линейчатого

спектра вещества зависят только от свойств атомов этого вещества и не зависят от способа

возбуждения свечения атомов. Атомы любого химического элемента дают спектр, не похожий на

спектры всех других элементов: они способны излучать строго определенный набор длин волн.

На этом основан спектральный анализ - метод определения химического состава вещества по его

спектру. С помощью спектрального анализа можно обнаружить данный элемент в составе

сложного вещества, если даже его масса не превышает 10

-10

М. Это очень чувствительный метод.

Изучают спектры с помощью спектрометров.

Количественный анализ состава вещества по его спектру затруднен, так как яркость спектральных

линий зависит не только от массы вещества, но и от способа возбуждения свечения. Так, при

низких температурах многие спектральные линии вообще не появляются. Однако при соблюдении

стандартных условий возбуждения свечения можно проводить и количественный спектральный

анализ.

В настоящее время определены спектры всех атомов и составлены таблицы спектров. Благодаря

сравнительной простоте и универсальности спектральный анализ является основным методом

анализа состава сложных, главным образом органических смесей. Спектральный анализ получил

широкое распространение в токсикологии, криминалистической медицине, при исследовании

микроэлементов в тканях и жидкостях организма.

Молекулярные спектры.

В молекуле составляющие ее ядра атомов колеблются вдоль соединяющей их прямой

линии связи, причем эти колебания специфичны для данного вида молекул; молекула также

вращается как целое в пространстве. Вследствие этого вся энергетическая молекулярная система

оказывается квантованной в соответствии с тремя основными видами энергии: энергии

электронных состояний, энергии колебаний атомов и энергии вращения молекулы.

Колебания ядер вдоль линии связи между атомами называются валентными, при этом

расстояние между атомами уменьшается или увеличивается, но сами атомы остаются на оси

валентной связи.

Колебания, связанные с изменением торсионного угла между плоскостями отдельных

групп атомов в молекуле получили название крутильных или вращательных.

При физиологических температурах колебания атомов в молекулах сопровождаются

изменениями длин связей между отдельными атомами на +

0,05Å (ангстрем, равен 10

-10

см), а угла

между связями – на +

Полная энергия молекулы E

записывается в виде:

= Е

эл

+ Е

вр

Эти три составляющие полной энергии отличаются друг от друга примерно в 10 раз.

При комнатной температуре молекула обычно находится в основном колебательном состоянии .

Энергия, соответствующая различным колебательным уровням, описывается выражением:

)

( νhVE

+= ,

где V – колебательное квантовое число, которое может принимать значения 0, 1, 2, 3 и т.д.; υ

–

характеристическая частота колебания атомов, образующих молекулу.

Вращательная энергия двухатомной молекулы в первом приближении выражается:

)1(

IhJJ

вр

где J – вращательное квантовое число (0, 1, 2, 3 и т.д.); I – момент инерции молекулы.

Соотношения между энергиями, необходимыми для осуществления различных переходов

в двухатомной молекуле, показано схематично на рисунке 38.

Рисунок 38. Схематическое представление уровней энергии в двухатомной молекуле. Е

–

основное электронное состояние; Е

– первое возбужденное электронное состояние;

а – колебательные уровни атомов; б - вращательные уровни молекулы.

Поскольку для электронного уровня может изменяться колебательное состояние молекулы,

т.е. увеличиваться колебательное квантовое число, между двумя основными электронными

уровнями (Е

и Е

) появляется ряд колебательных уровней, которые изображены на левой части

рисунка 38 . С учетом изменения вращательных состояний каждый из них разбивается на ряд еще

более тесных вращательных уровней, которые показаны на правой части рисунка 38. Поглощение

небольшого количества энергии, соответствующего, например, броуновскому движению молекул

при комнатной температуре или излучению в области СВЧ, может вызвать вращательные

переходы без изменения колебательных или электронных состояний.

Для того чтобы вызвать излучение, необходимо сообщить молекуле энергию большую,

чем энергия, при которой происходит ее возбуждение (рис. 39).

Рис. 39. Поглощение излучения с последующей потерей энергии:

а – переход в возбужденное состояние вследствие поглощения тепла (Н) или кванта излучения

(hν); б – излучение в виде кванта излучения (-hν) или в виде тепла (Н) ; в –переход между

близкими энергетическими уровнями не сопровождается излучением; г – резонанс. Колебательные

уровни обозначены буквами V

, V

и т.д.

Значения энергий квантовых переходов в молекулах даны в таблице 5.

Таблица 5.

Энергия квантовых переходов в молекулах

Переход Излучение Энергия Частота, Гц Длина волны