Чупахина Г.Н. Физиологические и биохимические методы анализа растений

Подождите немного. Документ загружается.

Содержание аскорбиновой кислоты выражается в мкг на грамм сырого

веса.

Литература

1. Hewitt E.J., Dickes G.J. Spectrophotometric мeasurements on аscorbic acid and

their use for the estimation of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in plant tissuer

// The biochemical Journal. 1961. V. 78. № 2. Р. 384 - 391.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Принцип метода количественного определения витамина С [1] основан

на его способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол, который

в щелочной среде имеет синюю окраску, а в восстановленном состоянии

бесцветный.

Количественное определение витамина С проводят, титруя исследуе-

мый раствор, подкисленный соляной кислотой, щелочным раствором

2,6-дихлорфенолиндофенола. Пока в титруемом растворе содержится ви-

тамин С, приливаемый щелочной раствор 2,6-

дихлорфенолиндофенола бу-

дет обесцвечиваться за счет образования восстановленной формы аскорби-

новой кислоты. Как только все количество витамина С, имеющееся в ис-

следуемом растворе, окислится, 2,6-дихлорфенолиндофенол не будет вос-

станавливаться и титруемый раствор приобретет розовую окраску за счет

перехода щелочного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола синего цвета в

2,6-дихлорфенолиндофенол красного цвета в кислой среде.

Зная количество 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на тит-

рование, и его титр, установленный по аскорбиновой кислоте, вычисляют

содержание аскорбиновой кислоты в исследуемом растворе.

Ход работы

Точную навеску исследуемого материала (сухих ягод шиповника - 1 г,

хвои - 1 г, капусты - 5 г, картофеля - 5 г) тщательно растирают в фарфоро-

вой ступке с 4 мл 2%-ной соляной кислоты, добавив немного измельченно-

го стекла. Затем без потерь переносят содержимое ступки в мерную колбу

на 25 мл, несколько раз смывая ступку водой и сливая ее по стеклянной

палочке в ту же колбу, и доводят объём раствора дистиллированной водой

до метки. Полученную смесь оставляют на 5 - 10 мин. Содержимое колбы

тщательно перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр и фильтрат

используют для определения витамина С. Экстракт, полученный из карто-

феля, не фильтруют.

Для титрования отмеривают в коническую колбочку определенный

объем фильтрата (шиповника - 1

мл, хвои - 5 мл, капусты - 5 мл, картофеля

- всю полученную смесь без фильтрации), добавляют 4 мл 2%-ного раство-

ра соляной кислоты и титруют из бюретки 0,001н. раствором 2,6-

дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исче-

зающего около 30 с. В контрольной пробе вместо вытяжки берется соот-

ветствующий объем смеси: 4 мл 2%-ной соляной кислоты и 21 мл воды.

Определение титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола

В мерной колбе на 50 мл растворяют несколько кристалликов (1-1,5 мг)

аскорбиновой кислоты в 2%-ной серной кислоте и доводят этой же кисло-

той до метки, тщательно перемешивают. В две конические колбочки берут

по 5 мл приготовленного раствора аскорбиновой кислоты и после добавле-

ния кристалликов KJ (около 5 - 10 мг) и 5 капель 1%-ного раствора крах-

мала титруют одну

колбочку 2,6-дихлорфенолиндофенолом, другую - точ-

но 0,001 н. раствором KJO

(0,03568 г KJO

растворяют в воде и доводят до

1 л). Расчет титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой

кислоте ведут по формуле:

a088,0

⋅

= ,

где

Т - количество миллиграммов аскорбиновой кислоты, соответствующее

1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола; 0,088 - количество мг аскор-

биновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,001 н. раствора йодата калия;

а - количество мл 0,001 н. раствора йодата калия, израсходованного на

титрование раствора аскорбиновой кислоты;

б - количество мл раствора

2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на титрование.

Расчет количества аскорбиновой кислоты в пробе производят по фор-

муле:

ГБ

100BAT

⋅

= ,

где

Х - содержание аскорбиновой кислоты в миллиграмм-процентах;

Т - титр раствора 2 ,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кисло-

те, т.е. это количество аскорбиновой кислоты (мг), соответствующее 1 мл

раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола;

А - количество раствора 2 ,6-дихлорфенолиндофенола (мл), израсходо-

ванное на титрование, за вычетом контроля;

Б - количество мл вытяжки, взятое для титрования; В - обще количест-

во вытяжки (мл);

Г - количество вещества в граммах, взятое для анализа; 100 - количест-

во граммов исследуемого материала, взятое для вычисления процентного

содержания.

Реактивы

1. Соляная кислота, 2%-ный раствор.

2. Аскорбиновая кислота, кристаллическая.

3. Серная кислота, 2%-ный раствор.

4. KJ, кристаллический;

5. Крахмал, 1%-ный раствор.

6. KJO

, точно 0,001 н. раствор (0,03568 г KJO

растворяют в воде и до-

водят до 1 л).

7. 2,6-дихлорфенолиндофенол, 0,001 н. раствор. Для приготовления

этого раствора применяют буферную фосфатную смесь (1/15 М) по Серен-

сену, так как индикатор в водном растворе довольно быстро разрушается.

Для этого берут водяные растворы КН

РО

- 9,078 г в 1 л и Nа

НРО

2Н

О -

11,867 г в 1 л. Растворы хранят отдельно. Затем их смешивают в соотно-

шении 2:3, тогда рН = 6,9 -7,0. Отвешивают 0,25 г красителя, приливают

700 мл дистиллированной воды, взбалтывают и добавляют 300 мл буфер-

ной смеси. На следующий день раствор отфильтровывают и тщательно пе-

ремешивают. Определяют титр приготовленного раствора.

Литература

1. Сиянова Н.С., Хисамутдинова В.И., Неуструева С.Н. Методическое руко-

водство для практикума по биохимии. Казань: Изд-во Казанского ун-та, 1988.

С.90 - 94.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Витамин С - аскорбиновая кислота (антицинготный фактор) – раство-

рим в воде. В особенно больших количествах он содержится в свежих яго-

дах, плодах (актинидии, черной смородины, апельсина, лимона) и овощах

(стручковых перцах, цветной капусте, брокколи, брюссельской капусте,

кресс-салате, укропе, листьях петрушки и др.). В растворах витамин С

очень чувствителен к кислороду

воздуха и нагреванию.

Аскорбиновая кислота обладает сильными восстановительными свой-

ствами. Продуктом ее первого окисления является дегидроаскорбиновая

кислота. В молекуле аскорбиновой кислоты 2 энольные группы, которыми

обусловлены ее кислотные свойства.

СО - СОН = СОН - НС - НОСН - СН

ОН

L - аскорбиновая кислота

СО - СО - СО - НС - НОСН - СН

ОН

дегидроаскорбиновая кислота

Метод определения аскорбиновой кислоты основан на ее редуцирую-

щих свойствах. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола синей окраски вос-

станавливается в бесцветное соединение экстрактами растений, содержа-

щими аскорбиновую кислоту (реакция Тильманса).

Реактивы и аппаратура

1. 1%-ная соляная кислота.

2. 1%-ный водный раствор щавелевой кислоты, которым заменяют ме-

тафосфорную кислоту.

3. 2%-ная серная кислота.

4. Аскорбиновая кислота кристаллическая.

5. KJ.

6. 1%-ный раствор крахмала.

7. 10%-ный раствор сернокислой меди.

0,001 н. раствор KJO

(навеску 0,3568 г йодата после двух часов вы-

сушивания при 102

С растворяют в воде в мерной колбе на 1 дм

; из этого

0,1 н. раствора берут 100 см

и доводят водой до 1 дм

; раствор удобно

хранить в склянке с установленной микробюреткой, наполняющейся рас-

твором снизу при помощи «груши»).

0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола - краска (растворяют

60 мг сухой краски в мерной колбе на 200 см

, прибавляют 100-150 см

те-

плой дистиллированной воды и 4-5 капель 0,01 н. щелочи; после сильного

10-минутного взбалтывания доливают колбу водой до метки и, перемешав,

фильтруют через плотный фильтр в сухую колбу).

10. Две микробюретки с градуировкой на 0,01 см

, емкостью 1 и 5 см

11. Бюретка с делениями на 0,05 см

12. Ступка диаметром 15 см.

13. Нож из нержавеющей или хромированной стали.

14. Кюветы эмалированные, лучше винипластовые, размером 20

X40 см.

Установка титра краски по аскорбиновой кислоте

(по С. М. Прокошеву)

Несколько кристаллов (около 1-1,5 мг) аскорбиновой кислоты раство-

ряют в 50 см

2%-ной серной кислоты. Затем 5 см

этого раствора титруют

раствором краски из микробюретки. Сразу после этого другую пробу с 5

см

раствора аскорбиновой кислоты титруют из другой микробюретки

точно 0,001 н. раствором иодата, причем в колбочку перед титрованием

прибавляют несколько кристалликов ( около 5-10 мг) йодистого калия и 5

капель 1%-ного раствора крахмала (более высокие количества йодистого

калия сильно тормозят окисление аскорбиновой кислоты йодом). Расчет

титра краски производится по следующей формуле:

⋅

a088,0

X мг аскорбиновой кислоты,

где: a - число кубических сантиметров точно 0,001 н. раствора йодата;

b - число кубических сантиметров раствора краски;

0,088 мг аскорбиновой кислоты соответствуют 1 см

0,001 н. раствора

йодата.

Пример вычисления титра 2,6-дихлорфенолиндофенола

На титрование пошло 1,32 см

краски и 1,68 см

йодата. Следовательно,

1 см

раствора краски эквивалентен (0,088

1,68):1,32=0,112 мг аскорбино-

вой кислоты.

Среднюю пробу (плодов, кочанов, корнеплодов, клубней, листовых

овощей) предварительно грубо измельчают ножом из нержавеющей или

хромированной стали на плексигласовой пластинке или в ростильне (следы

железа, и особенно меди, катализируют разрушение аскорбиновой кисло-

ты). Весь процесс измельчения необходимо выполнить как можно быстрее.

Средняя проба составляется из не

менее чем 10-20 экземпляров, поэтому

пробу для анализа берут так, чтобы в соответствующей пропорции в нее

входили все ткани каждого экземпляра.

Обычно отрезают сегмент толщиной 0,5-1 см после того, как объект

разрезан на две половины по главной оси. Полученные таким образом сег-

менты ткани быстро измельчают ножом в винипластовой или эмалирован-

ной кювете

на мелкие кусочки и перемешивают.

Крупные сочные плоды (томатов и т. п.) режут по вертикальной оси на

4 части, берут одну часть от каждого плода, измельчают в винипластовой

плоской чашке ножом или грубо растирают в большой фарфоровой ступке

и перемешивают. Среднюю пробу мелких плодов и ягод (сливы, смороди-

ны) измельчают в

ступке целиком. Из плодов косточковых предварительно

вынимают косточки. Среднюю пробу листовых овощей (укропа, сельдерея,

петрушки, пера лука и пр.) измельчают целиком или же берут 1/2 листовой

пластинки ( по оси) каждого листа, входящего в среднюю пробу (шпината,

салата, листовой капусты, щавеля и пр.).

Из измельченного и хорошо перемешанного материала берут в химиче-

ские стаканчики на 50 см

или на часовые стекла две параллельные навески

на технохимических весах для определения аскорбиновой кислоты. При

одновременном анализе нескольких образцов следует стремиться все на-

вески для определения аскорбиновой кислоты сразу залить раствором со-

ляной кислоты и потом уже растирать в ступке до образования гомогенной

массы.

При анализе навеску исследуемого материала в 5-20 г или больше (в

зависимости от содержания аскорбиновой кислоты) заливают в ступке 20

см

1%-ной соляной кислоты и растирают до образования гомогенной мас-

сы. Процесс растирания не должен длиться больше 10 минут. При анализе

грубых тканей их растирают в присутствии 2-3 г (в зависимости от навес-

ки) хорошо промытого стеклянного песка, который берут по объему. По-

лученную массу сливают из ступки (через стеклянную палочку и воронку)

в мерную колбу на 100 см

. Ступку споласкивают несколько раз 10%-ной

щавелевой кислотой, которую выливают в ту же мерную колбу. Содержи-

мое колбы доводят до метки 1%-ной щавелевой кислотой и закрывают ее

пробкой, сильно встряхивают и оставляют стоять около 5 минут. Затем со-

держимое колбы выливают на сухой фильтр и отфильтровывают часть экс-

тракта (около 50 см

) в сухой стакан или колбу.

Соляная кислота извлекает из растительной ткани как свободную, так и

связанную аскорбиновую кислоту. Щавелевая же кислота улучшает стой-

кость аскорбиновой кислоты в экстрактах.

Для титрования вытяжек из полученного фильтрата пипеткой берут две

параллельные порции по 10-20 см

, наливают в стаканчик объемом 50 см

титруют из микробюретки 0,001 н. раствором краски (2,6-дихлорфенолин-

дофенола) до появления явно-розового окрашивания, не исчезающего в те-

чение 0,5-1 минуты.

Вытяжки из богатых аскорбиновой кислотой объектов можно с успе-

хом титровать из бюретки с делениями на 0,05 см

, и объемы вытяжек,

употребляемых для титрования, могут быть увеличены до 20 см

Ввиду стойкости аскорбиновой кислоты в присутствии щавелевой ки-

слоты титрование готовых вытяжек при необходимости можно отложить

до следующего дня. При вычислении результатов вводят поправку и на ре-

активы.

При необходимости произвести особо точные анализы следует принять

в расчет и другие вещества, которые могут реагировать с 2,6-

дихлорфенолиндофенолом. Для этого к другим

двум порциям по 10 см

ис-

следуемой вытяжки прибавляют 0,1 см

10%-ного раствора сернокислой

меди и нагревают 10 минут при 110

С (на бане или в термостате) и после

охлаждения титруют краской. В присутствии меди и при нагревании ас-

корбиновая кислота полностью разрушается. Полученную поправку вычи-

тают из данных титрования опытных растворов.

Определение аскорбиновой кислоты в окрашенных вытяжках

Многие плоды и ягоды и некоторые овощи дают окрашенные экстрак-

ты, что затрудняет определение аскорбиновой кислоты вышеописанным

способом. Аскорбиновую кислоту окрашенных вытяжек титруют раство-

ром 2,6-дихлорфенолиндофенола (краски) в присутствии хлороформа, ди-

хлорэтана или толуола.

Навеску (10 г) экстрагируют как обычно и доводят объем экстракта до

100-200 см

раствором щавелевой кислоты. После фильтрования берут пи-

петкой 5 см

окрашенного экстракта в пробирки (диаметр 20-25 мм, длина

150 мм) и туда же прибавляют мерным цилиндром по 5 см

химически

чистого хлороформа. Затем вытяжку титруют раствором краски при осто-

рожном перемешивании, наклоняя пробирку, прикрытую пробкой.

При появлении первого розового окрашивания в слое хлороформа тит-

рование считается законченным. Одновременно проводят такое же титро-

вание контрольных проб с той разницей, что вместо экстракта в пробирки

прибавляют смесь растворов соляной и щавелевой

кислот в соотношении

объемов 1:5.

Количество аскорбиновой кислоты (

X) в образце вычисляют по форму-

ле:

ноб

обТа100

⋅

= ,

где: а - число куб. см краски (с вычетом поправки на титрование чистого

растворителя), которая пошла на титрование экстракта;

Т - титр краски по аскорбиновой кислоте;

об - общий объем вытяжки;

об

- число куб. см экстракта, взятого для титрования;

н - навеска материала.

Литература

1. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Ярош Н.П.,

Луковникова Г.А. Методы биохимического исследования растений. Л.: Колос,

1972. С. 88-92.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ

И ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТ

(по Дж. Божику)

Определение общего содержания аскорбиновой

и дегидроаскорбиновой кислот

Отбирают пипеткой 5 или 10 см

вытяжки, в которой определена ас-

корбиновая кислота (по вышеописанному способу), в коническую колбу на

50 см

, туда же добавляют 3,5 см

1 н. раствора серной кислоты и после пе-

ремешивания - 1,75 см

1 М раствора Na

После нового перемешивания закрывают колбочку резиновой пробкой

и оставляют на 10 минут. Через 10 минут добавляют в ту же колбу 2,5 см

1 М раствора хлорной ртути и 5,75 см

воды (11,5 см

в случае, если взято

5 см

вытяжки). После перемешивания образовавшийся осадок отфильтро-

вывают. Фильтрат бесцветный, а если вытяжка была окрашена, она час-

тично обесцвечивается. Затем к 5 или 10 см

фильтрата прибавляют соот-

ветственно 10 или 20 см

воды и титруют раствором 2,6-дихлорфе-

нолиндофенола. Вычисляют содержание аскорбиновой кислоты, как ука-

зано ниже. Полученные результаты представляют общее содержание ас-

корбиновой и дегидроаскорбиновой кислот. По разности между этим ко-

личеством и содержанием аскорбиновой кислоты узнают содержание де-

гидроаскорбиновой кислоты в пробе.

Для определения аскорбиновой кислоты в колбы на 50 см

берут по

5-10 см

вытяжки, приготовленной для определения аскорбиновой кисло-

ты, и последовательно прибавляют следующие реактивы: 3,5 см

1 н. рас-

твора серной кислоты, 2,5 см

раствора уксуснокислого свинца и 5 см

во-

ды (или 10 см

, если взято 5 см

вытяжки). После добавления каждого рас-

твора содержимое колбы перемешивают вращением. Под конец выпадает

осадок (он сероватый, тянущийся, что обусловлено присутствием высоко-

молекулярных веществ). Содержимое колбы интенсивно перемешивают

вращением в течение 10 секунд, а затем добавляют 2,5 см

95%-ного эти-

лового спирта. Реакционную смесь опять перемешивают, фильтруют через

бумажный фильтр, отбирают 5 или 10 см

фильтрата и титруют 2,6-дихлор-

фенолиндофенолом.

Для вычисления аскорбиновой кислоты с учетом разведений применя-

ется следующая формула:

обобн

100обобТа

⋅⋅

⋅

⋅⋅

= = мг на 100 г,

где:

а - количество куб. см краски, которое пошло на титрование пробы

(об

);

Т - титр краски;

об

- первоначальный объем вытяжки, полученной из навески;

об

- часть вытяжки, взятой для дальнейшего определения;

об

- объем, полученный в результате обработки части первоначальной

вытяжки;

об

- объем вытяжки, взятой на титрование краской;

н - навеска.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С В ОКРАШЕННЫХ ОБЪЕКТАХ

(по Бекеру)

Принцип метода: 2,5-динитрофенилгидразин с дегидроаскорбиновой

кислотой дает соединение, образующее с серной кислотой осадок красного

цвета, интенсивность которого измеряют фотометрически.

Реактивы и аппаратура

1. 2%-ная щавелевая кислота (С

2. Ацетатный буферный раствор, рН 5,4, который смешивают с 2%-ной

щавелевой кислотой в отношении 2:1 и разбавляют водой 1:1.

3. 2,6-дихлорфенолиндофенол - ДИФ (0,2 г растворяют в 1000 см

во-

ды, сосуд хорошо закрывают и хранят в холодильном шкафу).

4. Уксусноамиловый эфир или хлороформ.

5. 10%-ный раствор тиомочевины в водном спирте 1:1 (раствор неус-

тойчив).

6. 2,4-динитрофенилгидразин - ДФГ (3 г растворяют в 100 см

9 н. сер-

ной кислоты и фильтруют; устойчив около 4 недель).

7. 85%-ная серная кислота.

8. L-аскорбиновая кислота - АК (приготовляют стандартный раствор

для построения кривой растворением 0,60 г аскорбиновой кислоты в

200 см

2%-ного раствора щавелевой кислоты).

9. Центрифуга, объем пробирок 50 и 100 см

10. Баня со льдом.

11. Гомогенизатор.

Ход анализа

Растительный материал измельчают под углекислым газом. Затем берут

определенную навеску, в которой должно содержаться около 5 мг аскор-

биновой кислоты, смешивают со 120 см

2%-ной щавелевой кислоты, го-

могенизируют (2 минуты при 4 тыс. об/мин) и после тщательной промывки

стакана и ножа 2%-ной щавелевой кислотой доводят до определенного

объема. Экстракт взбалтывают и после центрифугирования берут пипеткой

5 см

прозрачного раствора в другую центрифужную пробирку, в которую

уже заранее налито 12 см

ДИФ; спустя полминуты - 10 см

хлороформа и

взбалтывают до тех пор, пока лишняя краска не перейдет в органический

растворитель, который после центрифугирования удаляют. Из водной фазы

пипеткой берут в два стаканчика по 4 см

жидкости, туда же добавляют 1

см

ДФГ и каплю раствора тиомочевины; пробу ставят для реакции в тер-

мостат на 75 минут при 50

. Второй химический стакан обрабатывают точ-

но так же, но без добавления ДФГ. После охлаждения в ледяной бане до-

бавляют еще 5 см

85%-ной серной кислоты и спустя час измеряют экс-

тинкцию при 540 нм. Незадолго до того во второй стакан добавляют 1 см

ДФГ.

Для построения калибровочной кривой из стандартного раствора, со-

держащего 30 мкг АК в 1 см

, берут 5 проб. В первую добавляют 1 см

рас-

твора аскорбиновой кислоты + 4 см

2%-ной щавелевой кислоты, что со-

ставляет 30 мкг на 5 см

, затем в последующие приливают по 2 см

, 3 см

4 см

, 5 см

аскорбиновой кислоты и щавелевой кислоты так, чтобы общий

объем раствора в каждой пробирке составлял 5 см

. Затем пробы просмат-

ривают на фотоэлектроколориметре и строят калибровочный график.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АСКОРБАТОКСИДАЗЫ, ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ

И ПЕРОКСИДАЗЫ

(по Д.К. Асамову, С.Т. Рахимовой)

В биохимических исследованиях чаще используются методы совмест-

ного определения активности аскорбатоксидазы и полифенолоксидазы, ос-

нованные на определении количества окисленной аскорбиновой кислоты.

Для определения аскорбиновой кислоты пользуются широко распростра-

ненным методом титрования с 2,6-дихлорфенолиндофенолом. Однако ме-

тод титрования имеет существенные недостатки: во-первых, окрашивание

раствора нестабильно, и поэтому трудно определить конец титрования

; во-

вторых, результат титрования зависит от времени титрования, а также от

освещенности и т.д.

Разработанный колориметрический метод определения аскорбиновой

кислоты позволил полностью избавиться от недостатков титрометрическо-

го метода и благодаря своей простоте и хорошей воспроизводимости ши-

роко применяется в биохимической практике. В этой связи данный метод

[1] использовался нами для

определения активности аскорбатоксидазы,

полифенолоксидазы и пероксидазы [2].

Для приготовления раствора краски - 2,6-дихлорфенолиндофенола - в

колбе объемом 100 мл растворяли 25 мг навески в теплой дистиллирован-

ной воде и добавляли 3-4 капли 0,01 н. раствора едкого натрия. Колбу

встряхивали до полного растворения краски, и объем раствора доводили до

метки водой.

Взвешивали 50 мг чистой аскорбиновой кислоты и растворяли

в 0,5 л

2%-ной метафосфорной кислоте. Из этого раствора брали по 0,5; 1; 1,5; 2;

2,5; 3; 3,5 мл и доводили до 50 мл 2%-ной метафосфорной кислотой. Как

известно, метафосфорная кислота является одним из лучших стабилизато-

ров аскорбиновой кислоты в растворе; кроме того, она легко осаждает

белки. Полученные растворы содержали соответственно 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7