Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.
- Москва, МИТХТ им. М.В. Ломоносова, АНО "ИБП", 2015. — 116 с.
Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе
бионанотехнологии)
Научный руководитель: д.х.н. Селищева А.А. Целью работы стал поиск диагностических маркеров и отработка методологии их применения для выявления механизма развития СД1, оценки степени гликирования и окисления альбумина, выделенного из сыворотки крови пациентов с СД1 и для ранней диагностики развития у них нейрональных осложнений.
Научная новизна Проведено систематическое изучение влияния окислительного гликирования на различные характеристики человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) invitroв условиях нормо-и гипергликемии, а также при нефизиологической концентрации глюкозы с учётом особенностей коммерческого альбумина. Было обнаружено, что альбумин, в котором сульфгидрильные группы частично окислены, подвержен гликированию в большей степени,чем ЧСА с нормальным содержанием SH-групп.
Разработан метод разделения ЧСА на окисленную и восстановленную фракции с помощью анионообменной хроматографии и предложен показатель(коэффициент отношения площадей пиков флуоресценции), характеризующий глико-окислительный статус белка.
Апробирован модифицированный метод выделения ЧСА из сыворотки крови с помощью аффинной хроматографии на голубом аффи-геле с перспективой использования этого метода в условиях клинической лаборатории. Впервые были изучены следующие свойства ЧСА, выделенном из сыворотки крови детей с СД1 и без нарушения углеводного обмена (контрольная группа): содержание кетоамина и егоположительная достоверная корреляция с HbAlc, содержание SH-групп, коэффициент отношения хроматографических пиков, отражающий глико-окислительный статус.
Впервые были исследованы аутоантитела (аАТ) к нейрональным белкам, имеющим различную локализацию в периферической нервной системе и в поджелудочной железе(S100, ФРН, ОБМ и ГФКБ) в сочетании с СД1 и наличием/отсутствием ДПН.Установили, что повышенный уровень нейрональных аАТ встречается с высокой частотой (более 30%) в крови детей, больных СД1, и это явление не зависит от продолжительности диабета и наличия ДПН. Поскольку нейрональные аАТ обнаружены как у детей с ранними сроками диабета, так и со стажем, можно предположить, что эти аАТ сохраняются довольно долго, в отличие от аАТ к компонентам β-клеток поджелудочной железы, которые кмоменту манифестации СД1 уже не обнаруживаются. Таким образом, аАТ к нейрональным белкам могут служить как предвестниками развития ДПН, так свидетелями уже происходящих нарушений. Установили, что ДПН встречается у детей с различными сроками заболевания практически с одинаковой частотой. Полученные данные по высокой частоте нейрофизиологических нарушений, не зависящей от компенсации углеводного обмена и продолжительности СД1, позволили предположить участиенейрогенных механизмов в развитии СД1.
При изучении динамики появления нейрональных аАТ у крыс с диабетом, вызванным СТЗ, обнаружили достоверный подъём аАТ к ГФКБи ФРНна 5-ый день после введения СТЗ с последующим снижением уровня антител. Кроме того, впервые было установлено, что наравне с аАТ к нейрональным белкам одновременно повышаютсяаАТ к инсулину. Это может свидетельствовать том, что два патогенетических процесса –гибель β-клеток и клеток нервной системы –идут одновременно. Поскольку в литературе отмечались нейрофизиологические нарушения у СТЗ-крыс (на 3-7 дни после введения СТЗ –в ЦНС, спустя 2 месяца –в ПНС), нейро аАТ можно рассматривать как предвестниковразвития ДПН.
Практическая значимость работы Измерение содержания проинсулина, (а не С-пептида и/или инсулина) может оказаться полезным для выявления механизмов развития СД
1. Для оценки эффективности инсулинотерапии и её коррекциипредложены двамаркера: содержание кетоамина в ЧСА и коэффициент отношения площадей пиков, полученных при анион-обменной ВЭЖХ (AI/AII), которые могут охарактеризоватьглико-окислительное состояниеЧСА. Использование аАТ к нейрональным белкам в качестве диагностических маркеров ДПН позволит предположить развитие данного осложнения без применения ЭМГ (что актуально для детей младшего возраста) и, следовательно, своевременно начинать превентивное лечение.
Научный руководитель: д.х.н. Селищева А.А. Целью работы стал поиск диагностических маркеров и отработка методологии их применения для выявления механизма развития СД1, оценки степени гликирования и окисления альбумина, выделенного из сыворотки крови пациентов с СД1 и для ранней диагностики развития у них нейрональных осложнений.
Научная новизна Проведено систематическое изучение влияния окислительного гликирования на различные характеристики человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) invitroв условиях нормо-и гипергликемии, а также при нефизиологической концентрации глюкозы с учётом особенностей коммерческого альбумина. Было обнаружено, что альбумин, в котором сульфгидрильные группы частично окислены, подвержен гликированию в большей степени,чем ЧСА с нормальным содержанием SH-групп.
Разработан метод разделения ЧСА на окисленную и восстановленную фракции с помощью анионообменной хроматографии и предложен показатель(коэффициент отношения площадей пиков флуоресценции), характеризующий глико-окислительный статус белка.
Апробирован модифицированный метод выделения ЧСА из сыворотки крови с помощью аффинной хроматографии на голубом аффи-геле с перспективой использования этого метода в условиях клинической лаборатории. Впервые были изучены следующие свойства ЧСА, выделенном из сыворотки крови детей с СД1 и без нарушения углеводного обмена (контрольная группа): содержание кетоамина и егоположительная достоверная корреляция с HbAlc, содержание SH-групп, коэффициент отношения хроматографических пиков, отражающий глико-окислительный статус.
Впервые были исследованы аутоантитела (аАТ) к нейрональным белкам, имеющим различную локализацию в периферической нервной системе и в поджелудочной железе(S100, ФРН, ОБМ и ГФКБ) в сочетании с СД1 и наличием/отсутствием ДПН.Установили, что повышенный уровень нейрональных аАТ встречается с высокой частотой (более 30%) в крови детей, больных СД1, и это явление не зависит от продолжительности диабета и наличия ДПН. Поскольку нейрональные аАТ обнаружены как у детей с ранними сроками диабета, так и со стажем, можно предположить, что эти аАТ сохраняются довольно долго, в отличие от аАТ к компонентам β-клеток поджелудочной железы, которые кмоменту манифестации СД1 уже не обнаруживаются. Таким образом, аАТ к нейрональным белкам могут служить как предвестниками развития ДПН, так свидетелями уже происходящих нарушений. Установили, что ДПН встречается у детей с различными сроками заболевания практически с одинаковой частотой. Полученные данные по высокой частоте нейрофизиологических нарушений, не зависящей от компенсации углеводного обмена и продолжительности СД1, позволили предположить участиенейрогенных механизмов в развитии СД1.
При изучении динамики появления нейрональных аАТ у крыс с диабетом, вызванным СТЗ, обнаружили достоверный подъём аАТ к ГФКБи ФРНна 5-ый день после введения СТЗ с последующим снижением уровня антител. Кроме того, впервые было установлено, что наравне с аАТ к нейрональным белкам одновременно повышаютсяаАТ к инсулину. Это может свидетельствовать том, что два патогенетических процесса –гибель β-клеток и клеток нервной системы –идут одновременно. Поскольку в литературе отмечались нейрофизиологические нарушения у СТЗ-крыс (на 3-7 дни после введения СТЗ –в ЦНС, спустя 2 месяца –в ПНС), нейро аАТ можно рассматривать как предвестниковразвития ДПН.
Практическая значимость работы Измерение содержания проинсулина, (а не С-пептида и/или инсулина) может оказаться полезным для выявления механизмов развития СД
1. Для оценки эффективности инсулинотерапии и её коррекциипредложены двамаркера: содержание кетоамина в ЧСА и коэффициент отношения площадей пиков, полученных при анион-обменной ВЭЖХ (AI/AII), которые могут охарактеризоватьглико-окислительное состояниеЧСА. Использование аАТ к нейрональным белкам в качестве диагностических маркеров ДПН позволит предположить развитие данного осложнения без применения ЭМГ (что актуально для детей младшего возраста) и, следовательно, своевременно начинать превентивное лечение.