Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
медицинских наук: 03.03.04 — клеточная биология, цитология,
гистология. — Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им.
В.А.Алмазова, Геронтологический исследовательский центр
Национального института старения США (г. Балтимор, США),
Валленберговский Нейрологический Центр Люндского Университета (г.
Люнд, Швеция). — Санкт-Петербург, 2011. — 89 с.
Научные консультанты: академик РАН, доктор биологических наук,
профессор Никольский Н.Н., профессор, M.D., Ph.D. Брюндин Патрик
(Швеция).
Цель исследования
Изучить механизмы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток и разработать способ заместительной клеточной терапии локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии в условиях эксперимента.
Научная новизна исследования
Выявлена биологическая роль фактора роста фибробластов 20 (FGF-20), который был идентифицирован ранее, но биологическая роль которого до сих пор оставалась неизвестной. В ходе проведения экспериментов по направленной дифференцировке чЭСК в нейроны in vitro было установлено, что фактор роста фибробластов 20 стимулирует дифференцировку и поддерживает выживаемость дофаминергических прогениторных клеток, что может способствовать повышению эффективности клеточной терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний.
Впервые установлена существование обратной зависимости между временем пребывания чЭСК в культуре in vitro (пропорциональным доле постмитотических клеток в общем объеме гетерогенной популяции производных чЭСК) и риском развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте трансплантации клеточного материала.
Сформулирована концепция «окна возможности» проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии, в пределах которого в культуре in vitro можно получить достаточное количество дофаминергических нейронов-производных чЭСК, и при этом выживаемость донорских дофаминергических нейронов в ходе трансплантационной процедуры является приемлемой, а риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте/сайтах трансплантации клеточного материала отсутствует, что особенно важно при последующем применении заместительной клеточной терапии у пациентов пожилого и старческого возраста.
Разработан и использован в экспериментальной работе двухэтапный протокол направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны in vitro, который позволяет получить однородную популяцию содержащих такие клетки клеточных агрегатов, пригодных к трансплантации непосредственно, то есть без диссоциации. Разработана также техника трансплантации таких клеточных агрегатов. Установлено, что использование этой технологии многократно повышает выживаемость донорских дофаминергических нейронов в сайте трансплантации, одновременно полностью ликвидируя риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) у реципиентов трансплантации.
Разработана технология, позволяющая проводить эффективное размножение эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в культуре in vitro (экспансию чЭСК) в сложных клеточных системах, основанных на применении фидерных клеток человеческого происхождения.
Проведена комплексная оценка параметров транскриптомов стволовых клеток разных типов в сравнении с транскриптомами иных типов клеток (не стволовых). В результате проведенного анализа выявлены важные закономерности и идентифицирована панель молекулярных мишеней, играющих важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки стволовых клеток.
Разработана, запущена в опытное производство и начала применяться в экспериментальной биологии специализированная микрочиповая (микроматричная) платформа «NeuroStem» предназначенная для изучения транскриптома стволовых клеток человека в ходе дифференцировки в клетки нейрального/нейронального ряда. Данная микрочиповая платформа обладает рекордными характеристиками в отношении представленности на ней молекулярных мишеней, имеющих отношение к биологии дофаминергической системы, в значительной степени способствуя прогрессу в разработке надежных, безопасных и эффективных методов клеточной терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний.
Научно-практическое значение
Применение технологии размножения эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в культуре in vitro (экспансии чЭСК) в сложных клеточных системах, основанных на применении фидерных клеток человеческого происхождения снижает влияние ксеногенных факторов на клетки человека, что снижает ксеногенные риски в случае практического применения производных этих клеток в формате клеточной терапии, понижает влияние ксеногенных факторов на параметры транскриптома и протеома клеток человека, что важно для верной интерпретации полученных научных результатов. Кроме того, применение для экспансии чЭСК клеток человеческого происхождения является значительно более удобным по сравнению с клетками мыши.
Проведенный широкомасштабный анализ транскриптомов стволовых клеток разных типов в сравнении с транскриптомами иных типов клеток позволил идентифицировать панель молекулярных мишеней, играющих важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Отдельные молекулярные мишени из состава данной группы могут быть использованы в качестве мишени генной модификации клеток
(с использованием технологии генной инженерии) для воздействия на процессы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток разных типов, - в том числе в интересах генной и генно-клеточной терапии ассоциированных с возрастом заболеваний.
Разработанная, апробированная и запущенная в производство специализированная микрочиповая (микроматричная) платформа «NeuroStem» позволяет с высокой производительностью и высоким качеством исследовать транскриптом стволовых клеток человека, нейронов и глиальных клеток разных типов, а также динамику транскриптома стволовых клеток человека в ходе дифференцировки в клетки нейрального/нейронального ряда. Это позволяет получать ценную информацию о фундаментальных механизмах, лежащих в основе жизнедеятельности стволовых клеток, нейронов, и их коммитированных предшественников. В свою очередь, это может иметь большое значение для идентификации новых диагностических, прогностических и терапевтических мишеней терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний.
Применение фактора роста фибробластов 20 (FGF-20) в качестве добавки в составе питательной среды используемой для культивирования производных стволовых клеток человека in vitro в ходе их направленной дифференцировки в дофаминергические нейроны позволяет повысить эффективность исходного протокола, что определяет возможность получения из чЭСК большое количество жизнеспособных и функциональных дофаминергических нейронов для использования в исследовательской работе и в качестве субстрата заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии.
Установленная обратная зависимость между временем пребывания чЭСК в культуре in vitro и риском развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте трансплантации клеточного материала, и сформулированная концепция «окна возможности» проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии позволили адаптировать существующие подходы к основанной на применении стволовых клеток терапии, минимизировав риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте/сайтах трансплантации клеточного материала донорского происхождения.
Разработанный и апробированный в эксперименте двухэтапный протокол направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны in vitro позволяет получить однородную популяцию содержащих такие клетки клеточных агрегатов, что даёт возможность избежать проведения этапа диссоциации клеток при проведении трансплантации. Использование такой технологии многократно повышает выживаемость донорских дофаминергических нейронов в сайте трансплантации, что открывает новые перспективы перед подходами к заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии. Разработанная технология будет способствовать дальнейшему прогрессу в создании безопасных и удовлетворяющих клиническим требованиям патогенетически обоснованных методов лечения ассоциированных с возрастом заболеваний, сопровождающихся локализованным нейродегенеративным процессом.
Изучить механизмы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток и разработать способ заместительной клеточной терапии локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии в условиях эксперимента.
Научная новизна исследования
Выявлена биологическая роль фактора роста фибробластов 20 (FGF-20), который был идентифицирован ранее, но биологическая роль которого до сих пор оставалась неизвестной. В ходе проведения экспериментов по направленной дифференцировке чЭСК в нейроны in vitro было установлено, что фактор роста фибробластов 20 стимулирует дифференцировку и поддерживает выживаемость дофаминергических прогениторных клеток, что может способствовать повышению эффективности клеточной терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний.
Впервые установлена существование обратной зависимости между временем пребывания чЭСК в культуре in vitro (пропорциональным доле постмитотических клеток в общем объеме гетерогенной популяции производных чЭСК) и риском развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте трансплантации клеточного материала.
Сформулирована концепция «окна возможности» проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии, в пределах которого в культуре in vitro можно получить достаточное количество дофаминергических нейронов-производных чЭСК, и при этом выживаемость донорских дофаминергических нейронов в ходе трансплантационной процедуры является приемлемой, а риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте/сайтах трансплантации клеточного материала отсутствует, что особенно важно при последующем применении заместительной клеточной терапии у пациентов пожилого и старческого возраста.
Разработан и использован в экспериментальной работе двухэтапный протокол направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны in vitro, который позволяет получить однородную популяцию содержащих такие клетки клеточных агрегатов, пригодных к трансплантации непосредственно, то есть без диссоциации. Разработана также техника трансплантации таких клеточных агрегатов. Установлено, что использование этой технологии многократно повышает выживаемость донорских дофаминергических нейронов в сайте трансплантации, одновременно полностью ликвидируя риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) у реципиентов трансплантации.
Разработана технология, позволяющая проводить эффективное размножение эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в культуре in vitro (экспансию чЭСК) в сложных клеточных системах, основанных на применении фидерных клеток человеческого происхождения.
Проведена комплексная оценка параметров транскриптомов стволовых клеток разных типов в сравнении с транскриптомами иных типов клеток (не стволовых). В результате проведенного анализа выявлены важные закономерности и идентифицирована панель молекулярных мишеней, играющих важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки стволовых клеток.
Разработана, запущена в опытное производство и начала применяться в экспериментальной биологии специализированная микрочиповая (микроматричная) платформа «NeuroStem» предназначенная для изучения транскриптома стволовых клеток человека в ходе дифференцировки в клетки нейрального/нейронального ряда. Данная микрочиповая платформа обладает рекордными характеристиками в отношении представленности на ней молекулярных мишеней, имеющих отношение к биологии дофаминергической системы, в значительной степени способствуя прогрессу в разработке надежных, безопасных и эффективных методов клеточной терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний.
Научно-практическое значение
Применение технологии размножения эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в культуре in vitro (экспансии чЭСК) в сложных клеточных системах, основанных на применении фидерных клеток человеческого происхождения снижает влияние ксеногенных факторов на клетки человека, что снижает ксеногенные риски в случае практического применения производных этих клеток в формате клеточной терапии, понижает влияние ксеногенных факторов на параметры транскриптома и протеома клеток человека, что важно для верной интерпретации полученных научных результатов. Кроме того, применение для экспансии чЭСК клеток человеческого происхождения является значительно более удобным по сравнению с клетками мыши.
Проведенный широкомасштабный анализ транскриптомов стволовых клеток разных типов в сравнении с транскриптомами иных типов клеток позволил идентифицировать панель молекулярных мишеней, играющих важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Отдельные молекулярные мишени из состава данной группы могут быть использованы в качестве мишени генной модификации клеток
(с использованием технологии генной инженерии) для воздействия на процессы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток разных типов, - в том числе в интересах генной и генно-клеточной терапии ассоциированных с возрастом заболеваний.
Разработанная, апробированная и запущенная в производство специализированная микрочиповая (микроматричная) платформа «NeuroStem» позволяет с высокой производительностью и высоким качеством исследовать транскриптом стволовых клеток человека, нейронов и глиальных клеток разных типов, а также динамику транскриптома стволовых клеток человека в ходе дифференцировки в клетки нейрального/нейронального ряда. Это позволяет получать ценную информацию о фундаментальных механизмах, лежащих в основе жизнедеятельности стволовых клеток, нейронов, и их коммитированных предшественников. В свою очередь, это может иметь большое значение для идентификации новых диагностических, прогностических и терапевтических мишеней терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний.
Применение фактора роста фибробластов 20 (FGF-20) в качестве добавки в составе питательной среды используемой для культивирования производных стволовых клеток человека in vitro в ходе их направленной дифференцировки в дофаминергические нейроны позволяет повысить эффективность исходного протокола, что определяет возможность получения из чЭСК большое количество жизнеспособных и функциональных дофаминергических нейронов для использования в исследовательской работе и в качестве субстрата заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии.
Установленная обратная зависимость между временем пребывания чЭСК в культуре in vitro и риском развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте трансплантации клеточного материала, и сформулированная концепция «окна возможности» проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии позволили адаптировать существующие подходы к основанной на применении стволовых клеток терапии, минимизировав риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте/сайтах трансплантации клеточного материала донорского происхождения.
Разработанный и апробированный в эксперименте двухэтапный протокол направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны in vitro позволяет получить однородную популяцию содержащих такие клетки клеточных агрегатов, что даёт возможность избежать проведения этапа диссоциации клеток при проведении трансплантации. Использование такой технологии многократно повышает выживаемость донорских дофаминергических нейронов в сайте трансплантации, что открывает новые перспективы перед подходами к заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии. Разработанная технология будет способствовать дальнейшему прогрессу в создании безопасных и удовлетворяющих клиническим требованиям патогенетически обоснованных методов лечения ассоциированных с возрастом заболеваний, сопровождающихся локализованным нейродегенеративным процессом.