Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук. — 03.01.06 – биотехнология (в том числе
бионанотехнологии). — Ульяновская государственная
сельскохозяйственная академия. — Ульяновск, 2011. — 54 с.
Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Дьяконов
Л.П., доктор биологических наук, профессор Савченкова И.П.
Цель работы – разработать новые биотехнологические
методы, направленные на получение инсулина in vitro, а также на
лечение инсулино-зависимого сахарного диабета мелких домашних
животных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Выделить из ПЖ плодов кролика, собаки, кошки β-клетки, очистить; изучить их свойства и признаки in vitro.
Провести гибридизацию β-клеток ПЖ плодов кролика с мутантной линией почки овцы, дефектной по тимидинкиназе (ПО ТК-).
Провести сравнительный анализ клонов межвидовых гибридных куль-тур ПО ТК- х β-клетки и отобрать клоны с высокой продукцией инсулина.
Адаптировать клоны с наиболее высокой продукцией инсулина к рол-лерно-суспензионному культивированию и получить суспензионные клоны гибридной культуры.
Изучить гистологическую совместимость межвидовых гибридных культур in vitro с сыворотками крови человека.
Разработать методы получения и культивирования примордиальных половых зародышевых клеток (ППЗК) свиньи.
Получить in vitro инсулин-секретирующие клетки, подобные β-клеткам ПЖ, путем направленной дифференцировки эмбриональных половых клеток (ЭПК) свиньи.
Осуществить трансплантацию β-клеток ПЖ плодов кролика лабораторным животным с экспериментальным СД и изучить влияние данной процедуры на течение заболевания.
Разработать метод трансплантации β-клеток ПЖ плодов кролика мел-ким домашним животным с диагнозом СД и изучить влияние трансплантации клеток на течение заболевания.
Научная новизна. Впервые из ПЖ собак и кошек получены культуры β-клеток, изучены их свойства и признаки in vitro. Оптимизированы методи-ки выделения β-клеток ПЖ плодов кроликов, разработаны методики выделения фетальных β-клеток кошек и собак.
Впервые посредством слияния получена гибридная культура почка ов-цы х β-клетки кролика (ПО ТК- х βкр), способная продуцировать инсулин in vitro.
Впервые получены и прокультивированы ППЗК свиней. Проведена направленная индукция ЭПК свиньи в инсулин-секретирующие клетки.
В опытах на лабораторных животных установлено, что ксенотрансплантация β-клеток ПЖ плодов кроликов нормализует течение экспериментального СД.
Впервые проведена клиническая трансплантация β-клеток ПЖ плодов кроликов мелким домашним животным, больным СД. При этом доказано, что в результате трансплантации происходит снижение уровня глюкозы в крови и моче, снижение дозы либо отказ от экзогенного инсулина, уменьшение возникновения сопутствующих диабету сосудистых осложнений.
Научно-практическая значимость работы. Разработан и запатентован способ выделения β-клеток кроликов, собак и кошек из плодной ПЖ на определенных сроках гестации и очистки их культивированием, а также способ лечения СД у собак и кошек, заключающийся в трансплантации β-клеток непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуносупрессивной терапии (патент на изобретение РФ №2325921). Указанный способ успешно используется в ряде ветеринарных клиник.
Разработаны и утверждены «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения».
Разработаны и утверждены «Методические рекомендации по лечению инсулинозависимого сахарного диабета (СД 1) собак и кошек методом внутрипеченочной трансплантации β-клеток плодов кроликов».
Полученные результаты расширяют представление о методах клеточной инженерии, направленных на получение клеточных культур, стабильно продуцирующих инсулин.
Полученные результаты открывают перспективы, позволяющие разрабатывать способы получения клеточного материала, используемого в терапии СД.
Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной клеточной биологии, биотехнологии, физиологии, фармакологии и клинической ветеринарии.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Выделить из ПЖ плодов кролика, собаки, кошки β-клетки, очистить; изучить их свойства и признаки in vitro.
Провести гибридизацию β-клеток ПЖ плодов кролика с мутантной линией почки овцы, дефектной по тимидинкиназе (ПО ТК-).
Провести сравнительный анализ клонов межвидовых гибридных куль-тур ПО ТК- х β-клетки и отобрать клоны с высокой продукцией инсулина.
Адаптировать клоны с наиболее высокой продукцией инсулина к рол-лерно-суспензионному культивированию и получить суспензионные клоны гибридной культуры.
Изучить гистологическую совместимость межвидовых гибридных культур in vitro с сыворотками крови человека.
Разработать методы получения и культивирования примордиальных половых зародышевых клеток (ППЗК) свиньи.
Получить in vitro инсулин-секретирующие клетки, подобные β-клеткам ПЖ, путем направленной дифференцировки эмбриональных половых клеток (ЭПК) свиньи.
Осуществить трансплантацию β-клеток ПЖ плодов кролика лабораторным животным с экспериментальным СД и изучить влияние данной процедуры на течение заболевания.
Разработать метод трансплантации β-клеток ПЖ плодов кролика мел-ким домашним животным с диагнозом СД и изучить влияние трансплантации клеток на течение заболевания.
Научная новизна. Впервые из ПЖ собак и кошек получены культуры β-клеток, изучены их свойства и признаки in vitro. Оптимизированы методи-ки выделения β-клеток ПЖ плодов кроликов, разработаны методики выделения фетальных β-клеток кошек и собак.
Впервые посредством слияния получена гибридная культура почка ов-цы х β-клетки кролика (ПО ТК- х βкр), способная продуцировать инсулин in vitro.
Впервые получены и прокультивированы ППЗК свиней. Проведена направленная индукция ЭПК свиньи в инсулин-секретирующие клетки.
В опытах на лабораторных животных установлено, что ксенотрансплантация β-клеток ПЖ плодов кроликов нормализует течение экспериментального СД.
Впервые проведена клиническая трансплантация β-клеток ПЖ плодов кроликов мелким домашним животным, больным СД. При этом доказано, что в результате трансплантации происходит снижение уровня глюкозы в крови и моче, снижение дозы либо отказ от экзогенного инсулина, уменьшение возникновения сопутствующих диабету сосудистых осложнений.
Научно-практическая значимость работы. Разработан и запатентован способ выделения β-клеток кроликов, собак и кошек из плодной ПЖ на определенных сроках гестации и очистки их культивированием, а также способ лечения СД у собак и кошек, заключающийся в трансплантации β-клеток непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуносупрессивной терапии (патент на изобретение РФ №2325921). Указанный способ успешно используется в ряде ветеринарных клиник.
Разработаны и утверждены «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения».
Разработаны и утверждены «Методические рекомендации по лечению инсулинозависимого сахарного диабета (СД 1) собак и кошек методом внутрипеченочной трансплантации β-клеток плодов кроликов».
Полученные результаты расширяют представление о методах клеточной инженерии, направленных на получение клеточных культур, стабильно продуцирующих инсулин.
Полученные результаты открывают перспективы, позволяющие разрабатывать способы получения клеточного материала, используемого в терапии СД.
Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной клеточной биологии, биотехнологии, физиологии, фармакологии и клинической ветеринарии.